Use of embryo cryopreservation techniques in assisted reproductive technology programs

На сегодняшний день криоконсервация эмбрионов широко применяется в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Возможность переноса замороженных/размороженных эмбрионов приводит к увеличению кумулятивной частоты наступления беременности, позволяет избежать повторных циклов стимуляции суперовуляции, снизить риск развития синдрома гиперстимуляции яичников, тем самым повышая эффективность и безопасность ВРТ [7, 31]. Криоконсервированные эмбрионы могут быть использованы после неудачного переноса нативных эмбрионов или, в случае успешного завершения беременности, при желании семейной пары иметь еще детей данные программы могут быть реализованы позже. Таким образом, криоконсервация эмбрионов является альтернативным вариантом использования оставшихся эмбрионов [20, 25].

В настоящий момент существуют два основных метода криоконсервации: метод медленного замораживания и активно развивающийся в последние несколько лет метод витрификации.

Первая беременность в результате переноса эмбрионов после криоконсервации методом медленного замораживания была получена австралийскими врачами А. Trounson и L. Mohr в 1983 г. Следуя технологии метода медленного замораживания, эмбрионы постепенно подвергают воздействию относительно низких концентраций криопротекторов. Режим медленного замораживания обеспечивают аппаратные устройства, так называемые «программируемые замораживатели». После достижения необходимой температуры соломинки помещают в жидкий азот и хранят при температуре -196 ^оС. Размораживание эмбрионов проводят при комнатной температуре в откалиброванных средах. Сидинг и очень медленная скорость замораживания, использующиеся в технологии медленного замораживания, обеспечивают внеклеточное образование кристаллов льда, тем самым способствуя снижению вероятности криоповреждения клеток эмбрионов.

Метод витрификации впервые был применен на мышиных эмбрионах в 1985 г. В начале 90-х гг. прошлого века появились первые сообщения об успешном переносе пациенткам эмбрионов, витрифицированных на стадии пронуклеусов и 2–3 дней развития. Описание первой беременности, закончившейся родами после переноса пациентке бластоцист, криоконсервированных методом витрификации, принадлежит японскому врачу Y. Yokota.

В основе метода витрификации лежит ультрабыстрая технология охлаждения, исключающая кристаллообразование. В процессе витрификации эмбрионы сначала подвергают воздействию относительно высоких концентраций криопротекторов, а затем их погружают непосредственно в жидкий азот.

Основным сдерживающим фактором в развитии метода витрификации являлась необходимость использования высоких концентраций криопротекторов, оказывающих токсический эффект и вызывающих осмотическое повреждение клеток. Прорыв в области витрификации был связан с внедрением различных технологий (Cryotop, Cryoloop, Cryo-E, Rapid-i и т.д.), приводящих к уменьшению объема охлаждаемого образца, что позволило снизить концентрацию криопротекторов и значительно повысить эффективность метода [17, 23, 24, 35]. На сегодняшний день лидирующая роль по совершенствованию метода витрификации и исследованию в области криоконсервации принадлежит японскому врачу M. Kuwayama. Длительность хранения эмбрионов не влияет на их качество. В исследовании, проведенном R. Riggs и соавт. в 2010 г., хранение эмбрионов в течение двадцати лет не оказывало влияния на такие параметры, как выживаемость после оттаивания, частота имплантации, частота наступления беременности, число выкидышей и родов [27].

В ряде исследований было показано, что число интактных бластомеров является важным прогностическим фактором наступления беременности после переноса размороженных эмбрионов [43, 44]. Несмотря на значительные успехи в области криоконсервации эмбрионов, до сих пор нет единого мнения относительно стадии развития эмбрионов, наиболее оптимальной для криоконсервации. В некоторых странах, в частности в Германии, криоконсервация эмбрионов после слияния пронуклеусов запрещена по этическим соображениям. В лабораториях других стран, особенно в последнее время, в связи с улучшением методов культивирования предпочтение отдается более поздним стадиям развития эмбрионов – 2-го и 3-го дней развития и стадии бластоцисты [1]. При применении метода медленного замораживания для криоконсервации эмбрионов на стадии зиготы выживаемость находилась в пределах 69–86,5% [22, 29], а частота наступления беременности не превышала 29%, что значимо уступало эффективности использования нативных зигот [39]. Тем не менее, по некоторым данным, выживаемость и клинические результаты были выше при криоконсервации эмбрионов на стадии пронуклеусов по сравнению с замораживанием эмбрионов на ранней стадии дробления [6, 22].

Появление метода витрификации позволило повысить выживаемость эмбрионов на стадии пронуклеусов до 81–93%, а также улучшить клинические результаты [13, 21]. В исследованиях, сравнивающих эффективность метода медленного замораживания и витрификации, получены следующие результаты. По данным M. Kuwayama и соавт., выживаемость 5881 витрифицированных на стадии пронуклеусов эмбрионов составила 100%, стадии дробления – 93%, а стадии бластоцисты – 52%. В то время как после криоконсервации эмбрионов на той же стадии развития методом медленного замораживания эти показатели составили 80, 90 и 41% соответственно [16]. Кроме того, S. Al-Hasani и соавт. получили более высокую частоту наступления беременности после витрификации (36,9%) по сравнению с медленным замораживанием (10,2%) [3].

По данным литературы, выживаемость при криоконсервации эмбрионов на стадии дробления методом медленного замораживания колебалась в пределах 43,1–80,6%, а частота наступления беременности составляла 18,3–46,9% [5, 29, 42]. При использовании метода витрификации большинству исследователей удалось достичь высокой выживаемости эмбрионов. В среднем этот показатель составил более 80%. Частота наступления беременности также была выше по сравнению с методом медленного замораживания и находилась в пределах 22–35% [16, 26, 35]. В более поздних исследованиях при использовании метода витрификации частоту наступления беременности удалось повысить до 49% [4].

Наибольший сравнительный анализ эффективности метода витрификации и медленного замораживания был проведен M. Kuwayama и соавт., которые показали, что выживаемость эмбрионов на стадии дробления после витрификации выше (98%) по сравнению с медленным замораживанием (91%). Но при этом частота наступления беременности при сравнении этих двух методов значимо не различалась и составила 51% для медленного замораживания и 53% для витрификации [16]. Однако сравнение результатов криоконсервации эмбрионов 3-го дня развития методом витрификации и медленного замораживания, проведенное G.A. Rama Raju и соавт., показало, что метод витрификации более эффективен по всем параметрам. Выживаемость (95,3%), частота имплантации (35%) и наступления беременности (14%) после витрификации значимо превышали эти показатели по сравнению с медленным замораживанием, которые составили в этой группе 60,0, 17,4 и 4,2% соответственно [26]. По данным B. Balaban и соавт. (2008), эмбрионы 3-го дня значительно лучше переносили витрификацию (94,8%), чем медленное замораживание (88,7%). Утилизация пирувата, отражающая уровень метаболизма, была выше у эмбрионов, подвергшихся витрификации. Кроме того, в витрифицированной группе число эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, было выше (60,3%) по сравнению с группой, подвергшейся медленному замораживанию (49,5%) [4]. В исследовании, проведенном M.R. Valojerdi и соавт. в 2009 г., метод витрификации также оказался более эффективным по сравнению с методом медленного замораживания [38]. Исследования, сравнивающие результаты криоконсервации бластоцист методом медленного замораживания и витрификации, показали следующее. По данным E.J. Stehlik и соавт., выживаемость бластоцист при использовании метода медленного замораживания составила 83,1%, а частота наступления беременности не превышала 16,7%. Эти показатели при использовании витрифицированных бластоцист достигли 100 и 50% соответственно [33]. По данным C. Huang и соавт., выживаемость бластоцист после витрификации была значительно выше (84%) по сравнению с бластоцистами, подвергшимися медленному замораживанию (56,9%) [12]. Однако в исследовании, проведенном J. Lieberman и M.J. Tucker, метод витрификации приводил к такой же выживаемости (96,5%) и частоте наступления беременности (46,1%), что и метод медленного замораживания (92,1 и 42,9%) [19]. Наибольший вклад внесло исследование, проведенное M. Kuwayama и соавт., в котором было использовано более 6000 бластоцист человека. Выживаемость после витрификации составила 90,0%, а частота наступления беременности – 53,0%, в то время как после медленного замораживания эти показатели были ниже – 84,0 и 51,0% соответственно [16].

Таким образом, по данным различных исследователей, выживаемость размороженных бластоцист при использовании протокола медленного замораживания находится в пределах 56,9–91,2%, а после витрификации – 79–100%. В недавно проведенном исследовании D. Zhu и соавт. результаты переноса витрифицированных эмбрионов на стадии бластоцисты оказались лучше по сравнению с переносом нативных бластоцист. Так, частота имплантации (37%) и частота наступления беременности (55,1%) статистически значимо превышали эти показатели в контрольной группе, которые составили 25,2 и 36,4% соответственно [45]. Исследования, проведенные K. Takahashi и соавт., показали, что частота врожденных пороков одинакова среди детей, полученных после переноса витрифицированных и нативных бластоцист (1,4%) [36]. J. Liebermann и M.J. Tucker также не выявили повышения частоты врожденных поро-ков после переноса витрифицированных и медленно замороженных бластоцист [19].

В литературе представлен ряд исследований, направленных на повышение выживаемости эмбрионов после криоконсервации. Предложенные методики включают в себя воздействие на такие криочувствительные компоненты клетки, как клеточная мембрана, цитоскелет, условия культивирования эмбрионов и другие [11, 15]. Бóльшая часть из них носит экспериментальный характер. Попытки улучшить результаты криоконсервации путем различных воздействий на эмбрионы требуют дальнейших исследований, в ходе которых удастся выбрать наиболее эффективные и включить их в протоколы криоконсервации.

Успешность программ ВРТ во многом зависит от качества и имплантационного потенциала переносимых эмбрионов [14, 28]. Для криоконсервации отбирают эмбрионы только хорошего и отличного качества. Однако оценка качества эмбрионов в основном строится на анализе их морфологических характеристик. В ряде исследований было показано, что корреляция между морфологическими параметрами эмбрионов и их жизнеспособностью и способностью к имплантации невысока [30]. Проведение преимплантационной генетической диагностики методом FISH также имеет ряд недостатков, ограничивающих его возможности. К ним относятся риск повреждения эмбриона в ходе проведения биопсии, мозаицизм, а также лимитированное количество исследуемых хромосом. Поэтому в настоящий момент активно изучаются альтернативные технологии скрининга анеуплоидии, например сравнительная геномная гибридизация, проводимая на клетках, полученных в ходе биопсии трофэктодермы бластоцист [2].

В недавнее время были предложены новые неинвазивные способы оценки жизнеспособности эмбрионов, в основе которых лежит анализ метаболизма, измерение специфических молекул (аминокислот, протеинов, глюкозы, жирных кислот и т.д.) в культуральной среде, коррелирующих с имплантационным потенциалом эмбрионов [34]. Так, например было показано, что эмбрионы с бóльшим уровнем потребления кислорода более жизнеспособны и характеризуются более высокой частотой имплантации [37, 41]. Метаболомика позволяет провести быструю неинвазивную оценку эмбрионов непосредственно перед переносом. Последующие исследования позволят определить возможность применения метаболических тестов в программах ВРТ, а дальнейшее совершенствование технологий позволит использовать данные тесты в рутинной практике.

Метод динамической морфологической оценки эмбрионов (time-lapse съемка) также является новым многообещающим направлением [18, 40]. Основные исследования в этой области нацелены на поиск морфологических маркеров, определяющих развитие эмбрионов хорошего качества с высоким потенциалом к имплантации.

Таким образом, криоконсервация эмбрионов является эффективным методом, значительно расширяющим возможности программ ВРТ. А метод витрификации является новым многообещающим подходом к криоконсервации эмбрионов человека на всех стадиях развития.