В последние годы большое внимание уделяется проблеме недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ), что связано с высокой распространенностью отдельных ее проявлений в популяции, которая по данным разных авторов составляет от 26 до 80% [1–3, 4]. Как известно, нДСТ представляет собой группу генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, объединенных нарушением формирования соединительной ткани в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально, под действием неблагоприятных факторов внешней среды у лиц с определенной генетической предрасположенностью.
Наличие недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ) следует рассматривать как фактор риска развития различных акушерских осложнений. В проведенных нами ранее работах была выявлена тенденция к более частому развитию неполноценного рубца (НР) матки после кесарева сечения у пациенток с нДСТ, морфологическим субстратом которого являлась прогрессирующая дезорганизация соединительной ткани вплоть до фибриноидного некроза, характеризующаяся нарушением содержания ламинина и коллагена IV типа.
Механическое растяжение стенки матки при беременности является повреждающим фактором, запускающим процессы репарации. Вероятная причина дезорганизации соединительной ткани при нДСТ может быть связана с относительной неполноценностью репаративных процессов, базирующихся на несовершенном ангиогенезе, что ведет к ишемическому повреждению соединительной ткани. С этих позиций интерес представляет выявление особенностей миометрия при нДСТ, предрасполагающих к нарушению течения репаративных процессов.
Целью данного исследования было изучение морфологических и молекулярно-генетических особенностей миометрия при нДСТ.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 90 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет, которые были разделены на 2 группы по наличию фенотипических признаков нДСТ (I – основная и II – группа сравнения). Критериями включения пациенток в исследование были: наличие признаков нДСТ, возраст пациенток (18 до 45 лет), срок беременности (38–40 недель). Критерии исключения: дифференцированные формы ДСТ, тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность.
Выделение пациенток с признаками нДСТ проводилось на основе классификации Т.И. Кадуриной [2, 3]. На основании полученных результатов пациентки были разделены на 2 группы: основную (выраженность нДСТ более 6 баллов), расцениваемую как группу пациенток с выраженной нДСТ, и группу сравнения (выраженность нДСТ менее 6 баллов) – пациентки без выраженной нДСТ.
Проводили гистологическое исследование миометрия, гистохимическую окраску гематоксилин-эозиноном и пикрофуксином по Ван Гизон серийных срезов. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4–5 мкм с первичными антителами к VEGF (Lab Vision). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике. Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды [5, 6]. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Статистическую обработку данных проводили с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 9.7 [7]. Для определения статистической значимости различий применяли критерии Фишера и Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Отношение шансов (OR) приведено с 95% доверительным интервалом (CI).
Результаты исследования и обсуждение
Все пациентки, включенные в исследование, были сопоставимы по возрасту и соматическому здоровью. Возраст беременных, включенных в исследование, колебался от 22 до 45 лет и составил в среднем 30,2±1,2 и 28,2±0,9 лет соответственно по группам. Анализ массо-ростовых отношений у обследованных нами беременных отклонений от популяционных норм не выявил: средняя масса тела составила 60,8±2,14 и 63,3±2,15 кг, средний рост 167,1±3,2 и 164,9±4,6 см соответственно по группам. Однако у пациенток основной группы отмечались более высокие значения массо-ростового коэффициента – 2,9 и 2,7 соответственно, не имеющие статистической значимости.
Различий в частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве в группах выявлено не было, однако в основной группе чаще отмечались краснуха (54,7%), пневмония (17,6%) и ОРЗ (64,8%) (OR=1,2; CI=0,7–1,6 и OR=4,1; CI=0,9–6,9, OR=1,3; CI=0,6–2,1 соответственно), в то время как во II – ветряная оспа (20,5%), (OR=0,8; CI=0,4–1,3).
Среди заболеваний ЛОР-органов у пациенток основной группы превалировал хронический тонзиллит – 23,3% (OR=2,5; CI=1,7–2,9) и хронический гайморит – 8,9% (OR=2,4; CI=1,1–3,2). Значительный удельный вес в соматическом анамнезе в нашем исследовании у пациенток основной группы среди заболеваний сердечно-сосудистой системы составили пролапс митрального клапана – 20,9% (OR=4,4; CI=2,9–5,8) и вегето-сосудистая дистония – 46,2%, (OR=1,7; CI=1,4–2,6), кроме того, у пациенток данной группы в 2,5 раза чаще регистрировали варикозную болезнь. При изучении заболеваний желудочно-кишечного тракта нами была установлена более высокая частота хронического гастрита 22,4% (OR=1,6; CI=1,3–2,2) и гастродуоденита – 8,1 % (OR=3,2; CI=2,1–4,9) в основной группе. Среди заболеваний мочевыделительной системы у пациенток основной группы чаще диагностировали хронический пиелонефрит – 19,5% (OR=3,3; CI=2,1–4,9), и только в этой группе отмечены нефроптоз (4,3%) и мочекаменная болезнь (5,7%). Установлена высокая частота миопии в основной группе (у каждой 3-й пациентки) с превалированием миопии средней 20,5% (OR=1,4; CI=1,1–2,6) и высокой степени 8,6% (OR=1,4; CI=1,1–2,9), с хирургической коррекцией в 3,5% случаев. При изучении опорно-двигательного аппарата с целью уточнения степени выраженности нДСТ, было выявлено преобладание сколиоза и плоскостопия в основной группе. Кроме того, 11,9% (OR=2,3; CI=1,3–3,9) обследованных пациенток основной группы указывали на вывихи в анамнезе.
Подавляющее большинство пациенток обеих групп ранее наблюдались и лечились по поводу различных заболеваний женских половых органов. При изучении структуры гинекологической заболеваемости была отмечена высокая частота цервицита (у каждой 2-й пациентки) в I группе (65,2%) (OR=1,4; CI=1,2–2,3) и хронического сальпингоофорита (16,6%) (OR=3,3; CI=2,1–3,8). Дисфункция яичников встречалась только у пациенток I группы 9,0% (OR=2,4; CI=1,9–3,7).
Течение настоящей беременности в I триместре у пациенток основной группы осложнялось ранним токсикозом в 57,6% (OR=1,4; CI=1,2–3,9). Кроме того, отслойка хориона имела место в 8,1% (OR=1,6; CI=1,2–4,9), а угроза прерывания в 49,0% (OR=1,5; CI=1,2–2,7). Также была установлена более высокая частота осложненного течения II триместра в виде угрозы прерывания в 42,4% (OR=3,1; CI=1,3–8,6), с формированием истмико-цервикальной недостаточности в 8,6% случаев (OR=3,1; CI=1,6–8,9), потребовавшей проведения хирургической коррекции у пациенток основной группы. Из особенностей течения III триместра беременности следует отметить высокую частоту угрозы преждевременных родов – 20,9% (OR=2,1; CI=1,6–4,5), плацентарной недостаточности – 34,8% (OR=3,7; CI=2,1–7,9), и гипоксии плода – 17,1% (OR=2,7; CI=1,8–5,3). Также у пациенток основной группы чаще регистрировали патологию околоплодных вод в виде много- и маловодия, однако данные различия не имели статистической значимости.
Большинство пациенток были родоразрешены через естественные родовые пути – 79,2 и 84,6% соответственно. Следует отметить, что основными показаниями к оперативному родоразрешению были: преждевременное излитие околоплодных вод при отсутствии эффекта от родовозбуждения – 9,3 и 4,8% (OR=2,0; CI=1,2–4,5); слабость родовой деятельности – 12,4 и 1,3% (OR=1,6; CI=1,9–6,2); гипоксия плода – 5,0 и 2,5% соответственно (OR=1,5; CI=1,2–6,3).
В основной группе во время родов достоверно чаще диагностировали слабость родовой деятельности – 12,4%. Также чаще отмечались слабость потуг и дискоординация родовой деятельности, не имеющие статистической значимости, однако ставшие показаниями к экстренному оперативному родоразрешению в родах. Течение последового периода у пациенток с более выраженными симптомами нДСТ чаще осложнялось плотным прикреплением плаценты 5,7% (OR=1,2; CI=0,9–3,6), в связи с чем, была проведена операция ручного отделения плаценты и выделения последа. Средняя кровопотеря при родоразрешении составила 363,6±24,5 мл и 312,7±22,9 мл в I и II группах соответственно.
Изучение особенностей течения послеродового периода не выявило статистически значимых различий, однако у пациенток основной группы чаще диагностировали эндометрит 2,8% (OR=1,2; CI=0,2–3,7), субинволюцию матки 6,2% (OR=1,4; CI=0,3–6,3). Также только в основной группе имели место случаи позднего послеродового кровотечения, потребовавшие хирургического лечения.
Нами также изучен исход родов для плода и течение раннего неонатального периода у новорожденных. Анализ данных показал, что дети матерей основной группы имели более низкие показатели массо-ростового коэффициента и более низкую оценку состояния по шкале Апгар при рождении, однако данные результаты не имели статистической значимости. В раннем неонатальном периоде у новорожденных основной группы чаще отмечалась неонатальная желтуха – 19,5% (OR=1,8; CI=1,3–3,7), недостаточность питания – 10,5% (OR=1,8; CI=1,1–3,2), кровоизлияния в склеры – 17,6% (OR=3,4; CI=2,2–8,7). Также у этих детей чаще диагностировали синдром срыгивания – 4,3% (OR=1,4; CI=0,2–3,7).
Таким образом, было установлено, что для пациенток с нДСТ характерна более высокая частота развития осложнений в течение беременности и родов, обусловленная, по-видимому, особенностями структурной организации соединительной ткани.
При морфологическом исследовании ткани миометрия, полученной при первичном кесаревом сечении у женщин без признаков нДСТ, было обнаружено упорядоченное расположение гипертрофированных мышечных волокон, отек лейомиоцитов, наличие в строме большого количества соединительнотканных фибрилл, располагавшихся в экстрацеллюлярном матриксе (ЭЦМ) вдоль гладкомышечных клеток. Сосудистое русло было представлено в основном сосудами капиллярного и синусоидного типа. Воспалительный инфильтрат отсутствовал. В группе женщин со слабой степенью выраженности нДСТ обнаружили схожие изменения: лейомиоциты с отеком, соединительнотканные волокна в большом количестве и неравномерное их распределение. Сосудистое русло также было преимущественно представлено сосудами капиллярного и синусоидного типа, но вдоль некоторых из них определялась слабая лимфогистиоцитарная воспалительная инфильтрация. Отсутствие выраженных различий в контрольной группе и группе с минимальными проявлениями нДСТ подтвердило обоснованность объединения их в одну группу.
У женщин с высокой степенью выраженности нДСТ был выявлен более широкий спектр морфологических изменений. Основные структурные изменения диффузно-очагового характера были обнаружены в ЭЦМ. Имелись очаги мукоидного набухания с феноменом метахромазии при окраске толуидиновым синим, которые располагались как в периваскулярной ткани, так и независимо от близости сосудов. В периваскулярной ткани обнаружены очаговые скопления лимфо-гистиоцитарных элементов. Соединительнотканные волокна определялись в умеренном количестве и при окраске по Ван Гизону имели бледно-розовый цвет, располагались неравномерно и хаотично и имели разрывы. Встречались лейомиоциты с выраженным отеком и развитием гидропической дистрофии вплоть до фибриноидного некроза отдельных гладкомышечных клеток. Сосуды были представлены капиллярами и синусоидами в большом количестве, обнаруживались также венулы с дилатированными просветами, вокруг которых нередко располагались диапедезные кровоизлияния. По периферии кровоизлияний и очагов фибриноидного некроза определялась лимфогистиоцитарная инфильтрация с небольшой примесью лейкоцитов. Учитывая выявленные изменения в содержании миоцитов и компонентов ЭЦМ, было проведено определение коэффициента соотношения паренхиматозно-стромальных (0,6 и 1,1 соответственно) компонентов, который, как мы установили, был значительно ниже при выраженных симптомах нДСТ. Особенности сосудистого компонента миометрия послужили основой для оценки кровоснабжения миометрия. Был вычислен коэффициент васкуляризации (отношение объемной плотности сосудов в миометриии к суммарной объемной плотности миоцитов), который составил соответственно по группам 1,3 и 1,7, что отражает снижение васкуляризации при нДСТ.
При морфологическом исследовании миометрия было установлено нарушение паренхиматозно-стромальных отношений при нДСТ, которое выражалось в снижении содержания стромального компонента и снижении васкуляризации. Также следует отметить повреждение миоцитов в виде гидропической дистрофии при низкой степени нДСТ и апоптоз гладкомышечных клеток при высокой степени нДСТ, что может быть причиной нарушения гемодинамики в микроциркуляторном русле и развития тканевой гипоксии. Таким образом, при нДСТ имеются морфологические признаки дезорганизации соединительной ткани с воспалительными реакциями и дистрофическими изменениями лейомиоцитов, отражающие нарушение процессов репарации в миометриии. Учитывая результаты морфологического исследования миометрия, интерес представляло изучение структуры ЭЦМ, в частности, содержания коллагеновых волокон, ламинина и др.
Содержание ламинина в ЭЦМ, который часто связывают с генезом пролапса гениталий, было снижено. По-видимому, уменьшеное содержание ламинина обусловливает «слабость» миометрия и может являться основой развития таких осложнений, как угроза прерывания беременности, истмико-цервикальной недостаточности, аномалии родовой деятельности.
При анализе спектра коллагенов нами было выявлено преобладание коллагена III типа, являющегося эмбриональным типом коллагена, характерным для рубцовой ткани. При нормальном течении репаративных процессов данный коллаген должен замещаться на коллаген I типа. По-видимому, преобладание эмбрионального коллагена является фактором дезорганизации соединительной ткани. Было обнаружено увеличение содержания Соl IV типа в интерстициальной ткани, являющегося основным коллагеном базальных мембран сосудов, что может быть обусловлено как генетическими дефектами коллагенов, так и нарушениями катаболизма белков (матриксные металлопротеиназы (ММP), тканевые ингибиторы ММР (TIMP).
На следующем этапе был проведен анализ баланса ММP и TIMP, который выявил увеличение содержания ММP 2 как в ЭЦМ, так и в гладкомышечных клетках при нДСТ. При этом в I группе максимальная экспрессия маркера в фибробластах была выше, чем в группе сравнения. Учитывая влияние TIMP на активность ММP, была определена экспрессия TIMP1 и установлено увеличение последней в гладкомышечных клетках при нДСТ, менее значимое в сравнении с ММР.
Таким образом, в группе сравнения отмечается сбалансированное однонаправленное увеличение ММР и TIMP, тогда как при нДСТ ММР превалировали над ингибиторами, что может приводить к дезорганизации соединительной ткани.
Как известно, одним из возможных факторов, влияющих на катаболизм коллагенов, может быть дефицит магния, который, стабилизирует некодирующие РНК. Согласно полученным нами данным, при нДСТ имеет место достоверное снижение содержания магниевых каналов в гладкомышечных клетках до 2,9 балла (5,6 балла в группе сравнения), что приводит к дестабилизации РНК и, как следствие, увеличению активности ММР. В работах О.А. Громовой, И.Ю. Торшина (2009) описаны возможные механизмы магниевой недостаточности при нДСТ, в нашем исследовании показан один из возможных путей формирования магниевого дефицита при нДСТ в миометрии [8].
Следует отметить, что в подавляющем большинстве случаев в группе сранения отмечалось максимальное содержание магниевых каналов гладкомышечных клеток, в то время как в основной группе – только в 1/3 (рис. 1 см. на вклейке).
Центральная роль в регуляции ангиогенеза принадлежит семейству структурно близких между собой белков – факторов роста эндотелия сосудов. Наиболее изученным представителем этого семейства является VEGF-A, который контролирует морфогенез кровеносных сосудов, в то время как VEGF-C и VEGF-D ответственны за образование лимфатических сосудов [9]. Учитывая результаты морфологического исследования миометрия, свидетельствующие о нарушении неоангиогенеза, мы определили содержание VEGF. Было установлено снижение содержания VEGF в миометрии при нДСТ (не имеющее статистической значимости), что, возможно, отражает развитие компенсаторных реакций, возможным пусковым механизмом которых может являться тканевая гипоксия.
Изменение спектра коллагенов ЭЦМ миометрия является проявлением нДСТ и может быть обусловлено как генетическими дефектами, так и нарушениями их метаболизма, что подтверждается увеличением содержания ММP2 в ЭЦМ и гладкомышечных клетках. Дополнительным фактором может служить снижение экспрессии магниевых каналов при нДСТ, так как в эксперименте N. Pages (2003) показано повышение общей активности ММP 2 и ММP 9 при дефиците магния [10]. Активация ММP в свою очередь приводит к усилению деградации коллагенов и усилению процессов дезорганизации соединительной ткани. Значимый вклад вносит и развивающаяся тканевая гипоксия, индуцирующая неоангиогенез, несовершенный при нДСТ. Можно предположить, что предрасположенность к недостаточной экспрессии VEGF в ответ на повреждение у женщин с нДСТ приводит к неадекватному воспалительному ответу и недостаточному ангиогенезу с нарушением репарации ткани. Описанные изменения могут быть причиной относительной ишемии ткани при нДСТ, индуцирующей в свою очередь процессы дезорганизации соединительной ткани.
Заключение
Таким образом, характерными морфологическими признаками нДСТ являются обнаружение очагов дезорганизации соединительной ткани со снижением ее васкуляризации, развитием очагов мукоидного и фибриноидного набухания, проявлением отека стромы, очаговых кровоизлияний и интерстициальным склерозом, наличие лимфогистиоцитарного инфильтрата стромы.
К иммуногистохимическим проявлениям дезорганизации соединительной ткани миометрия при нДСТ относится накопление Col III, снижение васкуляризации с увеличением содержания CoI IV и снижением ламинина в ЭЦМ. Выявленные изменения могут являться основой, предрасполагающей к более высокой частоте развития акушерских осложнений при нДСТ.
