Дисплазия соединительной ткани, как известно, представляет собой группу генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, объединенных нарушением формирования соединительной ткани в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально под действием неблагоприятных факторов внешней среды у лиц с определенной генетической предрасположенностью.
Наличие недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ) следует рассматривать как фактор риска развития различных акушерских осложнений. В проведенных нами ранее работах была выявлена тенденция к более частому развитию неполноценного рубца (НР) матки после кесарева сечения у пациенток с нДСТ, морфологическим субстратом которого являлась прогрессирующая дезорганизация соединительной ткани, вплоть до фибриноидного некроза, характеризующаяся нарушением содержания ламинина и коллагена IV типа.
Механическое растяжение стенки матки при беременности является повреждающим фактором, запускающим процессы репарации. Вероятная причина дезорганизации соединительной ткани при нДСТ может быть связана с относительной неполноценностью репаративных процессов, базирующихся на несовершенном ангиогенезе, что ведет к ишемическому повреждению соединительной ткани.
Как известно, в животных организмах существуют два основных пути образования сосудов: ангиогенез и васкулогенез. Последний имеет место в эмбриогенезе и отвечает в основном за рост сосудов de novo из ангиобластов, в результате чего формируются первичные капиллярные сплетения эмбриона, тогда как ангиогенез — основной механизм роста уже сформированных сосудов.
Центральная роль в молекулярной регуляции ангиогенеза принадлежит семейству структурно близких между собой белков — факторов роста эндотелия сосудов (VEGF). Наиболее изученным представителем этого семейства является фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), который контролирует морфогенез кровеносных сосудов, в то время как VEGF-C и VEGF-D ответственны за образование лимфатических сосудов [4, 18].
Важную роль VEGF-A играет в эмбриогенезе, регулируя пролиферацию клеток трофобласта и эндотелия сосудов плода, а также созревание материнских и плодовых клеток крови [10]. У взрослых индивидуумов VEGF-A участвует в процессах репарации тканей и воспаления. Установлено, что повышенный уровень VEGF-A в сыворотке наблюдается при преэклампсии [21], меноррагии [16, 17].
Экспрессия гена VEGF-A регулируется различными факторами. Так, показано, что гипоксия способна вызывать повышение экспрессии VEGF-A [23], в том числе и в трофобласте [19].
Описан ряд полиморфизмов гена VEGF-A, связанных с развитием ревматоидного артрита [12],инфаркта миокарда [13], возрастной дегенерации сетчатки [6, 14]. Генотип 1154A/A ассоциирован с привычным выкидышем [8] и низкой вероятностью имплантации эмбриона при ЭКО [11].
У ребенка наличие определенных аллельных вариантов гена VEGF-A является фактором риска преждевременных родов [5] и ряда других перинатальных осложнений: врожденных пороков развития сердца [22], синдрома внезапной смерти внешне здорового ребенка (синдром апноэ во сне) [9]. Основным молекулярным механизмом реализации описанных эффектов является влияние данных полиморфизмов на уровень экспрессии VEGF-A. Варианты 2578С, -1154G, и -634C ассоциированы с высокой экспрессией гена [20]. Вариант 936T приводит к снижению уровня VEGF-A в крови [24], хотя в некоторых работах эта связь не обнаружена [7].
Вышесказанное обусловливает актуальность проведения работ по изучению морфологических и генетических механизмов неоангиогенеза в матке у пациенток с нДСТ.
Целью данного исследования было изучение морфологических и молекулярно-генетических особенностей неоангиогенеза в рубце матки у пациенток с нДСТ.
Материал и методы исследования
В исследование было включено 90 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет с рубцом на матке после кесарева сечения, которые были разделены на 2 группы по наличию фенотипических признаков нДСТ (1-я — основная и 2-я — группа сравнения). Выделение пациенток с признаками нДСТ проводилось на основе классификации Т.И. Кадуриной [1, 2]. Критерием включения в основную группу (60 пациенток) было наличие хотя бы одного из признаков нДСТ. Группа сравнения была сформирована из 30 пациенток с минимальными проявлениями нДСТ или без таковых.
Проводили гистологическое исследование рубца и прилежащего миометрия, гистохимическую окраску гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону серийных срезов. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм с первичными антителами к VEGF (Lab Vision). Результаты иммуногистохимическойреакции оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике. Для определения замен одиночных нуклеотидов применяли модифицированный метод «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов [3, 15]. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Статистическую обработку данных проводили с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 9.7 (J.N. Abramson, 2004). Для определения статистической значимости различий применяли критерии Фишера и Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Отношение шансов (OR) приведено с 95% доверительным интервалом (CI).
Результаты исследования и обсуждение
Большинство беременных, включенных в исследование, были в возрасте от 29 до 37 лет. При анализе антропометрических данных обследованных женщин отклонений от популяционных норм не выявлено.
Распределение фенотипических проявлений нДСТ у пациенток основной группы было следующим: миопия — 43,3%, пролапс митрального клапана — 13,3%, варикозная болезнь — 55%, нефроптоз — 1,7%. При этом у 50% выявили 1 признак нДСТ, у 35% — 2 признака, у 10% — 3 признака и у 5% — 4 признака. Течение настоящей беременности у пациенток обеих групп осложнялось угрозой прерывания на ранних сроках (20 и 33,3%). Однако поздние самопроизвольные выкидыши и отслойка хориона в анамнезе имели место только у пациенток с нДСТ (у 3 и 5% женщин соответственно). Также у пациенток с нДСТ чаще отмечали преэклампсию и плацентарную недостаточность. При проведении УЗИ признаки неполноценности рубца были установлены у 33,3% женщин с проявлениями нДСТ и у 20% в группе сравнения (OR = 2,0; CI = 1,1—3,8), в то время как при кесаревом сечении признаки неполноценности рубца выявлялись у48,3 и 36,7% (OR = 1,6; CI = 0,9—2,8) женщин соответственно. Среди исследованных фенотипических проявлений нДСТ наиболее информативными предикторами неполноценности рубца были миопия высокой степени (рис. 1) и пролапс митрального клапана.
Все женщины были родоразрешены путем кесарева сечения в сроки 37—40 нед. Масса тела доношенных новорожденных 1-й и2-й групп составила соответственно 3202,0±321,6 и 3348,9±353,1 г, длина — 50,0±1,6 и 50,9±1,7 см.
Течение послеоперационного периода у пациенток с нДСТ чаще осложнялось лохиометрой (6,7%), по поводу которой проводилась вакуум-аспирация полости матки.
При макроскопическом исследовании НР матки после кесарева сечения обнаруживались в большем проценте случаев у пациенток из группы с нДСТ и имели вид белых плотных, линейной формы втяжений в нижнем маточном сегменте. У нескольких пациенток рубцы имели вид полупрозрачной пленки (рис. 2, а см. на вклейке). В случае неполноценности рубца макроскопически определялись очаги свежих кровоизлияний с формированием интрамуральных гематом темно-красного цвета. Полноценные рубцы интраоперационно не визуализировались (рис. 2, б см. на вклейке).
При микроскопическом исследовании предполагаемой ткани рубца в группе сравнения обнаруживалась гладкомышечная ткань, разделенная тонкими фиброзными септами с сосудами капиллярного типа (рис 3, а см. на вклейке). Полноценные рубцы, видимые макроскопически, построены из грубых коллагеновых волокон с замурованными сосудами капиллярного типа со склерозированными стенками и небольшим количеством фибробластических элементов. В некоторых случаях имелись островки гладкомышечной ткани с гипертрофией миоцитов. В НР обнаруживались крупные очаги кровоизлияний с формированием интрамуральных гематом, полнокровные сосуды, а также артерии мелкого калибра с резко утолщенными склерозированными стенками и суженным просветом, очагами фибриноидного некроза и воспалительной клеточной реакцией. Наличие гематом являлось одним из ведущих микроскопических признаков неполноценности рубца. Так, интрамуральные гематомы при НР встречались в85% случаев.
При нДСТ в рубцах микроскопически выявлялись очаги дезорганизации соединительной ткани, прежде всего в периваскулярном пространстве, в виде мукоидного и фибриноидного набухания и фибриноидного некроза с клеточными реакциями (рис. 3, б см. на вклейке). В отличие от рубцов в группе сравнения, при нДСТ отмечалось меньшее количество сосудов капиллярного типа, а также более выраженный склероз и гиалиноз стенок артерий. В НР при нДСТ отмечались крупные очаги ишемического некроза с демаркационным воспалением, вблизи которых обнаруживались резко стенозированные и облитерированные артерии мелкого калибра. Некрозу подвергались островки гладкомышечных клеток в рубце. У некоторых пациенток имелись признаки жировой дистрофии лейомиоцитов. Следует отметить, что у 7 пациенток с нДСТ с макроскопически полноценным рубцом матки при микроскопическом исследовании были выявлены признаки его неполноценности.
Обобщая данные морфологического исследования, следует отметить, что заживление рубцов после кесарева сечения может происходить путем реституции и субституции, причем у женщин с нДСТ преобладает субституция с образованием ткани со сниженным количеством сосудов и очагами дезорганизации соединительной ткани. Патология сосудов при нДСТ в условиях родов приводит к развитию ишемических повреждений, вплоть до некроза, как рубцовой ткани, так и миометрия. Обнаружение микроскопических признаков неполноценности рубца у женщин с макроскопическими и ультразвуковыми признаками полноценного рубца обусловливает необходимость проведения повторного кесарева сечения у пациенток с нДСТ.
Снижение ангиогенеза в группе женщин с нДСТ подтверждается также и данными иммуногистохимического исследования (рис. 3, в, г см. на вклейке). VEGF накапливался в цитоплазме клеток эндотелия сосудов, макрофагов и фибробластических элементов рубца и окружающей ткани. VEGF в эндотелии сосудов был на одном уровне как в группе с нДСТ, так и в группе сравнения независимо от состояния рубца (рис. 4).
Экспрессия данного маркера в макрофагах и фибробластических элементах рубца была существенно ниже, чем в эндотелии сосудов, и также не различалась между группами в случае полноценности рубца. Установлена тенденция к более высокому содержанию фактора роста эндотелия в фибробластических элементах при НР у пациентов группы сравнения, что может быть обусловлено развитием воспалительной реакции, в отличие от женщин с нДСТ. Косвенным свидетельством вовлеченности воспалительной реакции может служить практически полное отсутствие признаков воспаления при морфологическом исследовании полноценного рубца. Можно предположить, что предрасположенность к недостаточной экспрессии VEGF в ответ на повреждение у женщин с нДСТ приводит к неадекватному воспалительному ответу и недостаточному ангиогенезу с нарушением репарации ткани. Описанные изменения могут быть причиной относительной ишемии ткани при нДСТ, индуцирующей процессы дезорганизации соединительной ткани.
Нами также были изучены частоты встречаемости полиморфизмов гена VEGF-A: -2578 A>C, -634 G>C и 936 C>T. Распределение генотипов у пациенток с нДСТ и в группе сравнения практически не различалось. Однако при морфологическом исследовании ткани рубцов у 80% пациенток с генотипом -634 С/C обнаружены НР с гематомами, в то время как среди пациенток с генотипами -634 G/C и -634 G/G частота выявления НР с гематомой была значительно ниже (40 и 22% соответственно) (рис. 5).
Отношение шансов (OR) возникновения НР с гематомами для пациенток с генотипом -634 С/C по сравнению с другими генотипами составило 10,0 (1,03-96,99), p=0,047. Среди пациенток с генотипом 936T/T морфологическое исследование не выявило НР с гематомами, тогда как у носительниц аллеля 936С НР с гематомами выявили в 38,7% случаев (рис. 6).
Из-за низкой частоты встречаемости генотипа 936T/T данные различия не были статистически значимыми. Распределение генотипов -2578 A>C не различалось среди пациенток с гематомами и без гематом. Полученные данные свидетельствуют о том, что особенности ангиогенеза в рубце после предыдущего кесарева сечения у женщин с нДСТ являются независимым фактором риска его неполноценности. Показана патогенетическая роль аллельных вариантов гена VEGF-A в нарушении ангиогенеза, приводящем к локальной ишемии и дезорганизации соединительной ткани.
Таким образом, в проведенном исследовании, помимо выявления высокой частоты НР матки у пациенток с нДСТ, была установлена высокая степень корреляции между формированием НР матки и такими клиническими проявлениями нДСТ, как миопия высокой степени и пролапс митрального клапана.
Установлено, что НР при нДСТ характеризуются относительно сниженным уровнем ангиогенеза, что может приводить к дезорганизации соединительной ткани, обусловленной локальной ишемией. Микроскопическими признаками неполноценности рубца являются очаги дезорганизации соединительной ткани, апоптоз прилежащих лейомиоцитов, а также наличие интрамуральных гематом. Одним из генетических факторов риска развития интрамуральных гематом, вероятно, является носительство аллеля 936С и генотипа -634 С/C гена VEGF-A.
