В настоящее время в мировом сообществе особое внимание уделяется патологии шейки матки с акцентом на предрак и рак шейки матки. Выявление цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) на ранних стадиях развития является глобальной и актуальной проблемой. К лабораторным методам ранней диагностики CIN относятся цитологический метод (PАР-тест или жидкостная цитология) и молекулярные методы выявления ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) [1]. Вместе с тем, чувствительность цитологического метода недостаточно высока и составляет 60–80% [2]. С недавнего времени наряду с цитологическим методом исследования лидирующую позицию занимает качественное и количественное определение ВПЧ. В современных условиях ВПЧ-тест необходимо проводить ввиду его высокой чувствительности. Исследования A.J. Blatt и соавт. (2015) показали приоритет сочетанного использования цитологического метода исследования и ВПЧ-тестирования по сравнению с проведением только цитологического или только ВПЧ-тестирования [3, 4]. Как показывает клинический опыт, нередки случаи расхождения результатов цитологического, гистологического, кольпоскопического исследований и ВПЧ-тестирования. Это подчеркивает необходимость поиска новых специфических маркеров, прогнозирующих риск развития и прогрессию CIN.
Малигнизация ВПЧ-инфицированных эпителиальных клеток шейки матки в значительной степени индуцируется синтезом двух онкобелков Е6 и Е7, кодируемых геномом ВПЧ [5]. Онкогенные белки Е6 и Е7 инактивируют ключевые белки-регуляторы пролиферативной активности клеток – проапоптотический белок р53 и белок ретинобластомы (pRB) [6]. Установлено, что белок Е7 способен образовывать стабильный комплекс с белком pRB, вызывая его деградацию, что приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который стимулирует транскрипцию генов, необходимых для репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла. Кроме того, Е7 влияет на активность целого ряда других белков-регуляторов клеточного цикла, таких как А- и Е-циклины, cdk2-киназа и ингибиторы циклин-зависимой киназы р21 и р27. Онкобелок E6 взаимодействует с белком p53, приводя к его убиквитинированию и последующей деградации в протеасоме. Вследствие этого нарушается процесс апоптоза клеток с встроенной ДНК ВПЧ [7].
Кроме того, опухоль-супрессорный белок p53 является ингибитором Wnt-сигнального пути. Есть данные, что активация этого пролиферативного сигнального каскада играет важную роль при трансформации ВПЧ-инфицированных клеток цервикального эпителия в опухолевые [8].
Важным компонентом Wnt-зависимой сигнальной системы является белок β-катенин, первоначально идентифицированный как регулятор активности белков адгезии – кадгеринов. В норме, в отсутствие Wnt-сигналов, β-катенин не активен благодаря ингибирующему действию мультимерного комплекса, в состав которого, помимо него самого, входят также ферменты киназа-3β гликогенсинтазы (GSK3β) и казеинкиназа 1α (CK1α), опухоль-супрессорный белок АРС (adenomatous polyposis coli) и проапоптотический белок аксин [9].
Ключевым механизмом регуляции, который обеспечивает поддержание низкого уровня β-катенина в клетке, является экспрессия и секреция антагонистов Wnt-каскада, которые бывают двух видов: белки, связывающие и блокирующие Wnt-лиганды, и белки, связывающие и блокирующие Wnt-рецепторы. Ключевым ингибиторным белком первой группы является Wnt-ингибиторный фактор 1 (Wnt Inhibitory Factor-1, WIF1) [10].
Показано, что в злокачественных опухолях человека различного происхождения фактор WIF1 находится в неактивном состоянии. И, напротив, восстановление экспрессии WIF1 в опухолевых клетках приводит к выраженной опухолевой супрессии, уменьшению подвижности опухолевых клеток и снижению их инвазивного и метастатического потенциала. При этом основным механизмом инактивации фактора WIF1 является промоторное ДНК-метилирование и, как следствие, эпигенетическое выключение кодирующего его гена, происходящее на ранних этапах онкогенеза [11–15].
Следует отметить, что данный эпигенетический механизм инактивации генов наряду с другими механизмами эпигенетической регуляции (модификации гистонов хроматина, микроРНК) широко распространен и общепризнан как один из основных молекулярных механизмов раннего канцерогенеза. Более того, сегодня практически для всех видов злокачественных новообразований известны характерные эпигенетические нарушения, возникающие на ранних этапах канцерогенеза и имеющие причинное значение. В подавляющем большинстве случаев это реакции аномального промоторного метилирования ДНК и деацетилирования гистонов, которые приводят к подавлению экспрессии генов, обеспечивающих онкопротекторные свойства организма. К таковым относятся опухоль-супрессорные гены, гены ДНК-репарации, гены ферментов детоксикации, гены ядерных (в том числе гормональных) рецепторов, гены клеточной дифференцировки, гены иммунного ответа, а также гены сигнальных белков, подавляющих гиперпролиферацию, патологический ангиогенез, инвазию и метастазирование, то есть базовые механизмы канцерогенеза. Доказано, что при спорадических раках как минимум половина всех инактивированных генов, контролирующих противоопухолевую защиту, являются транскрипционно неактивными вследствие обратимых эпигенетических модификаций, а не в результате необратимых генетических нарушений, как считалось ранее [16, 17].
Важное практическое значение имеет тот факт, что выявленные эпигенетические маркеры служат не только молекулярными мишенями для новых таргетных противоопухолевых препаратов, но одновременно являются основой для создания новых высокоселективных методов молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний. Эпигенетические маркеры все активнее начинают использоваться как инструмент раннего (доклинического) обнаружения и уточнения классификации онкологического заболевания, а также как факторы его клинического прогноза и мониторинга лечения. С их помощью можно оценить агрессивность опухоли (ее инвазивный и метастатический потенциал), а также успешность применения того или иного лекарственного препарата (наличие предсуществующей резистентности, вероятность развития приобретенной резистентности и появления рецидива заболевания) [18].
Все вышесказанное имеет непосредственное отношение к фактору WIF1. В настоящее время уже получены данные, свидетельствующие о том, что статус метилирования гена, кодирующего фактор WIF1, может рассматриваться как достоверный диагностический онкомаркер, а также прогностический клинический маркер в процессе комплексного лечения онкологических заболеваний [15].
Установлено, что инактивация гена WIF1 посредством промоторного гиперметилирования – достаточно частое событие при раке груди [11], гепатоцеллюлярной карциноме [19], а также целом ряде других онкопатологий. Подобные исследования проводились и для исследования статуса метилирования гена WIF1 при раке шейки матки. Результаты данных работ показывают, что при данной онкопатологии наблюдается высокий уровень метилирования промоторной области гена WIF1, что приводит к подавлению его экспрессии. При воздействии на культуры опухолевых клеток шейки матки C33A, CaSki, HeLa и SiHa известного деметилирующего агента5-аза-2’-дезоксицитидина активность гена WIF1 восстанавливалась [13].
Необходимость использования новых методов комплексной диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний диктуется недостаточной чувствительностью и специфичностью, в ряде случаев, стандартных первичных методов обследования шейки матки, неоднозначностью полученных при таком обследовании результатов, а также необходимостью смещения приоритетов в область профилактики предраковых и раковых заболеваний шейки матки и обнаружения их на как можно более ранних стадиях развития.
Целью настоящего исследования было оценить диагностическую значимость метилирования гена WIF1 в развитии CIN.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 62 пациентки в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст составил 35±1,2 года), которые обратились в ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова МЗ РФ для обследования и, при необходимости, лечения патологии шейки матки c февраля по август 2016 г. Пациенткам проводился клинический осмотр, жидкостная цитология, ВПЧ-тестирование, гистологическое исследование биоптата шейки матки, расширенная кольпоскопия, исследование метилирования гена WIF1. Оценка цитологических мазков проводилась по системе Бетесда (Terminology Bethesda System, TBS, 2014 г.). Согласно системе Бетесда плоскоклеточные интраэпителиальные поражения (SIL) подразделяются на 2 группы: плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени (LSIL), что приравнивается к клиническому диагнозу дисплазии легкой степени (то есть CIN I) и плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени (НSIL) и включает в себя умеренную и тяжелую дисплазию, то есть CIN II-III, а также карциному in situ (CIS).
ВПЧ-тестирование проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, позволяющим провести генотипирование и количественное определение двадцати одного типа ВПЧ (HPV КВАНТ-21) – 16,18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, 6, 11.
Окончательная верификация диагноза SIL проводилась на основании гистологического исследования.
Всем пациенткам была проведена расширенная кольпоскопия с применением 3% раствора уксусной кислоты и раствора Люголя. При наличии измененных и/или подозрительных участков шейки матки производилась прицельная биопсия или петлевая электроэксцизия, а при наличии HSIL – конизация шейки матки. По показаниям было произведено выскабливание цервикального канала.
Для выявления метилирования гена WIF1, взятые с помощью зонда цервикс-браш (Cervix Brush) образцы клеток из цервикального канала были помещены в пробирку с буфером PBS (натрий-фосфатный буфер), трижды промыты PBS и заморожены при температуре -20o С перед отправкой на исследование.
Реагенты: PBS (натрий-фосфатный буфер) (Cell Signalling Technologies, США), этанол (Sigma-Aldrich, США).
Полученные образцы клеток шейки матки гомогенизировали в гомогенизаторе FastPrep-24 (MPBiomedicals, США) с добавлением матрикса D. Из полученных образцов выделяли ДНК с использованием и по протоколу набора ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System (Promega, США). Концентрацию ДНК определяли флуориметрически с использованием стандартного набора Qubitds DNA HSAssay Kit на флуориметре Qubit 2.0 (Life Technologies, США).
150 нг полученной ДНК подвергали бисульфитной конверсии (переводу неметилированных остатков цитозина в тимин при сохранении метилированных остатков цитозина в неизмененном виде) с использованием набора innuCONVERTBisulfiteBasicKit (Analytik Jena, Германия). Концентрацию конвертированной ДНК определяли фотометрически в планшете µ-drop (BMGLabtech, Германия) с использованием мультидетектора CLARIOstar (BMGLabtech, Германия).
20 нг бисульфит-конвертированной ДНК отбирали для последующей «тачдаун» ПЦР-амплификации с использованием полимеразной смеси GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega, США) и праймеров, позволяющих амплифицировать участок промотора гена WIF1 от -554 до -140 нуклеотидов до старт-кодона [20] и содержащих, помимо комплементарной последовательности, универсальную последовательность M13 на 5’-конце, которая позволяет существенно повысить длину прочтения последовательности при проведении секвенирования:
WIF1-M13F
5’- gttttcccagtcacgacGAGTGATGTTTTAGGGGTTT -3’
WIF1-M13R
5’- ggaacagctatgaccatgCCTAAATACCAAAAAACCTAC -3’
Наличие и размер (длину) ПЦР-продуктов определяли посредством электрофореза в 2,5% агарозном геле с маркерами молекулярного веса 100 bpMolecularRuler (Bio-Rad, США). Полученные ПЦР-продукты выделяли из геля с использованием набора innuPREPDOUBLEpureKit (Analytik Jena, Германия).
Секвенирование проводилось в центре коллективного пользования «ГЕНОМ» на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по стандартному протоколу с использованием прямых праймеров и набора реактивов ABIPRISM BigDye Terminatorv. 3.1. Анализ продуктов реакции проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием универсальных праймеров M13:
M13F
5’- GTTTTCCCAGTCACGAC -3’
M13R
5’- GGAAACAGCTATGACCATG -3’
Статистический анализ результатов секвенирования проводили с использованием программного обеспечения DNA Sequencing Analysis Software версии 5.1 (Applied Biosystems, США) и QUMA: quantification tool for methylation analysis [21]. Уровень ДНК-метилирования оценивали качественно (наличие/отсутствие). Определяли долю метилированных сайтов (уровень метилирования) в промоторной области гена WIF1 для каждого пациента, а затем рассчитывали среднее арифметическое значение данного показателя (M), а также величину стандартного отклонения в каждой группе пациентов (SD). Полученные значения выражали как M±SD. Значимость отличий между группами определялась по критерию Стьюдента при пороговом значении р<0,05. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 10.0.
Результаты и обсуждение
На основании проведенных исследований пациентки были разделены на 3 группы: 1-я группа – с верифицированным диагнозом LSIL (n=19); 2-я группа – пациентки с HSIL (n=18). Третью контрольную группу составили 25 здоровых женщин, у которых по данным цитологического исследования атипические клетки не выявлены (NILM); тест на ВПЧ – отрицательный; при проведении расширенной кольпоскопии изменений эпителия шейки матки не выявлено.
При тестировании на ВПЧ у пациенток 1-й группы в 26,3% случаев выявлялся 16-й тип, у 15,8% пациенток – 18-й тип, у 21% женщин – 33-й тип, другие типы ВПЧ – у 31,6%, сочетание 2 и более типов ВПЧ – в 26,3% случаев.
При тестировании на ВПЧ у пациенток 2-й группы наиболее часто выявлялся 16-й тип (44,4%), 18-й тип – у 33,3% пациенток, другие типы ВПЧ – у 22,2% пациенток, сочетание 2 и более типов вирусов – в 33,3% случаев.
Результаты секвенирования полученных образцов ДНК представлены на рис. 1.
Как видно из представленных данных, в образцах ДНК здоровых пациентов метилирование промоторной областигена WIF1 обнаружено только у 4 пациентов из 25, при этом средний уровень метилирования составил 2,3±5,4%.
Следует отметить, что у всех женщин с подтвержденным диагнозом LSIL и HSIL наблюдалось статистически значимое по сравнению с нормой (р<0,0001), аномальное гиперметилирование промоторных участков гена WIF1 со средней частотой соответственно 29,2±17,2% и 54,8±18,7%.
Кроме того, для сравнения уровня метилирования в группах NILM, LSIL и HSIL была построена диаграмма размаха (рис. 2). Достоверность различий определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони для множественных сравнений.
Для всех исследованных групп уровень метилирования промоторной области гена WIF1 статистически значимо отличался (для NILM и LSIL p=1,57×10‑7, для NILM и HSIL p=1,22×10‑8, для LSIL и HSIL p=4,36×10‑3).
Стоит отметить, что распределение пациентов по количеству сайтов метилирования во всех группах существенно отличалось от нормального (рис. 3). При этом распределения были бимодальными, что может свидетельствовать о наличии нескольких подгрупп (с разной степенью риска прогрессии заболевания) в каждой группе. Для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных ретроспективных исследований.
W.F. Van Der Meide и соавт. (2011) показали, что существует выраженная достоверная корреляция между уровнем метилирования промоторной области гена WIF1 и возникновением CIN (p<0,01) [13, 22].
Другими авторами несколькими годами позже было установлено, что определение частоты метилирования генов PAX1 и SOX1 в качестве биомаркера цервикального канцерогенеза позволяет добиться достаточно высокой чувствительности диагностики CIN – 86% [23].
Можно предположить, что изменение экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в процессы дифференцировки и регуляции стволовых клеток, является одним из ключевых факторов развития злокачественных новообразований в гормон-зависимых тканях репродуктивной системы.
К числу таких белков – транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию пролиферативных эмбриональных каскадов, относится и фактор WIF1. Есть все основания считать, что уровень метилирования кодирующего данный белок гена достоверно коррелирует со стадией прогрессии CIN.
Полученные данные свидетельствуют о необходимости разработки современных схем комбинированной терапии с использованием препаратов, направленных на деметилирование гена WIF1 [20]. Так, в многочисленных экспериментальных исследованиях достоверно установлено, что к таким веществам, в частности, относятся флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG) и индольные соединения: индол-3-карбинол (I3C) и его физиологический метаболит – 3,3’-дииндолилметан (DIM). Показано, что EGCG способен снижать активность ДНК-метилтрансферазы, что приводит к деметилированию и, таким образом, реактивации генов в опухолевых клетках [24]. Z. Gao и соавт. (2009) установили, что EGCG эффективно деметилирует и реактивирует экспрессию эпигенетически «молчащего» гена WIF1 [21]. Эти данные могут свидетельствовать об эффективности применения EGCG и I3C в терапии заболеваний, ассоциированных с аномальным гиперметилированием генов, и в частности гена WIF1.
Выводы
- В норме метилирование промоторной области гена WIF1 не наблюдается или выражено слабо. Появление сайтов метилирования данного гена в норме может свидетельствовать о начальных стадиях формирования диспластического процесса в эпителии шейки матки.
- У женщин с диагнозом LSIL и HSIL наблюдается аномальное гиперметилирование промоторных участков гена WIF1. При этом уровень метилирования промоторного участка гена WIF1 статистически достоверно коррелирует со степенью тяжести CIN.
- Оценка статуса метилирования гена WIF1 может рассматриваться как потенциальный диагностический и прогностический маркер в комплексной диагностике CIN различной степени тяжести.
- Необходима разработка современных схем комбинированной терапии с использованием препаратов, обладающих эпигенетической активностью (ингибиторов ДНК-метилтрансфераз), восстанавливающих активность гена WIF1.
