В настоящее время проблема бесплодия является одной из наиболее актуальных. За последние годы отмечается значительный рост числа бесплодных браков без тенденции к снижению. По всему миру более 186 млн человек (примерно 8–29% супружеских пар по данным ВОЗ) являются бесплодными, среди которых большая часть – это жители развивающихся стран. Бесплодным считается брак, при котором не наступает беременность у супругов детородного возраста в течение одного года регулярной половой жизни без контрацепции. Причинами бесплодного брака могут быть нарушения как в женской репродуктивной системе, так и в мужской. Но все чаще бесплодие обусловлено сочетанными факторами. Для того чтобы определить причину бесплодия у супружеской пары, необходимо провести полное клинико-диагностическое обследование обоих супругов.
Основными причинами ненаступления беременности у супружеских пар являются нарушение процесса овуляции (эндокринное бесплодие) [1, 2], трубно-перитонеальное [3], эндометриоз-ассоциированное бесплодие [4], маточные [5] и мужские [6] факторы бесплодия. С каждым годом мужское бесплодие привлекает все больший интерес в связи со снижением качества спермы у молодых здоровых мужчин во всем мире [7–9]. Помимо патологических процессов, влияющих на фертильность, существенный вклад в развитие бесплодия привносят возраст супругов, их образ жизни, а также влияние окружающей среды. При этом примерно в 5–10% случаев причину отсутствия наступления беременности установить не удается.
В связи с этим отмечается стремительное развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), прежде всего экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Несмотря на то что ВРТ помогли в решении многих проблем бесплодия, частота успешных имплантаций эмбриона в полости матки до сих пор находится на достаточно низком уровне (около 25% всех попыток зачатия) [10]. Основными условиями для успешной имплантации являются: эмбрион с высоким имплантационным потенциалом, рецептивность эндометрия, а также синхронизация процессов эмбриогенеза и созревания эндометрия [11]. Получение большого числа ооцитов, благодаря стимуляции суперовуляции, позволило выбирать эмбрионы, наиболее подходящие для последующего переноса в полость матки [12]. Качество эмбриона служит основополагающим фактором успеха программ ВРТ при условии отсутствия влияния других факторов бесплодия.
Отбор эмбрионов для переноса в полость матки, как правило, производится на основании визуальной оценки их морфологических свойств, что остается общепринятым стандартом оценки качества эмбриона и, возможно, его имплантационного потенциала. Но не все эмбрионы хорошего морфологического качества успешно имплантируются [13]. Путь к появлению эмбриона хорошего качества начинается задолго до слияния мужской и женской гамет, а именно во время гаметогенеза. Вторым важным этапом формирования эмбриона является оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом, при котором гаплоидные наборы генома каждого родителя объединяются, формируя диплоидный геном новой уникальной зиготы. Во время этих процессов клетки и ткани, которые отвечают за выполнение репродуктивных функций, подвергаются постоянным преобразованиям на транскриптомном и протеомном уровнях. Поэтому поиск биомаркеров, регулирующих как гаметогенез в женском и мужском организмах, так и последующий эмбриогенез, является чрезвычайно актуальным для создания способа прогнозирования имплантационной способности эмбриона в программах ВРТ. При этом основными характеристиками биомаркеров должны быть: 1) относительно продолжительное время жизни после забора биоматериала, 2) доступность выделения без инвазивных вмешательств, 3) простота и быстрота измерения концентрации. В качестве таких биомаркеров ученые в последние годы рассматривают малые некодирующие РНК (мнРНК), которые важны для реализации многих клеточных процессов, выполняя свои регуляторные функции как внутри клетки, так и обеспечивая межклеточную коммуникацию [14]. Структура мнРНК, их размеры и способ их транспортировки позволяют им стабильно существовать в различных биологических жидкостях. В связи с этим достаточно перспективным исследованием можно считать выделение мнРНК из биологических жидкостей супружеских пар (фолликулярная жидкость, эякулят, культуральная среда бластоцисты) с целью оценки фертильности каждой супружеской пары.
Некодирующие белок РНК
По результатам двух основных проектов по анализу генома человека, HGP и ENCODE, было установлено, что около ⅔ генома активно транскрибируется, из них лишь 1,9% кодирует белки, а остальная часть транскриптома выполняет регуляторную функцию [15, 16]. При этом чуть больше половины транскриптома приходится на долю длинных некодирующих РНК (днРНК, длиной более 200 нуклеотидов) и мнРНК (длиной менее 200 нуклеотидов) [17]. Известна роль днРНК в эпигенетическом контроле хроматина, промотор-специфичной регуляции экспрессии гена, стабильности мРНК, инактивации Х-хромосомы и геномном импринтинге. К мнРНК относятся РНК, участвующие в трансляции (транспортные РНК, рибосомальные РНК), сплайсинге (малые ядерные РНК), модификации малых РНК (малые ядрышковые РНК), посттранскрипционной регуляции экспрессии генов (piwi-ассоциированные РНК, эндогенные малые интерферирующие РНК, микроРНК) [15].
Piwi-взаимодействующие РНК в основном специфичны для мужских половых клеток, в которых ключевой их функцией является подавление экспрессии транспозонов и повторяющихся элементов генома для его стабилизации [18], в то время как те же функции, но на территории женских половых клеток выполняют малые интерферирующие РНК [19]. Наиболее изученным классом мнРНК с точки зрения регуляции репродуктивной функции являются микроРНК, которые непосредственно взаимодействуют с мРНК-мишенью в составе мультибелкового (белки Argonaute) РНК-ингибирующего комплекса (RISC) и приводят к дестабилизации мРНК и репрессии трансляции как следствию влияния на функциональную активность поли(А)-связывающего белка (PABP) и белкового комплекса инициации трансляции eIF4F [20–22]. Более 60% мРНК содержат сайты связывания мкРНК в 3’-нетранслируемой области [23]. Более того, для многих типов мкРНК доказано наличие участков связывания сразу на нескольких сотнях различных молекул мРНК, что предполагает сложный и комбинаторный механизм действия мкРНК в регуляции экспрессии генов [24].
Роль микроРНК в фолликуло- и оогенезе
Оогенез – это сложный стадийный процесс дифференцировки, роста и созревания женских половых клеток [25]. Образовавшись из гоноцитов, оогонии многократно делятся митотически во время внутриутробного развития плода. Дальнейшее развитие заключается в периоде роста и накопления дейтоплазматических веществ (превителлогенез). Последовательно наступают стадии пролептотены, лептотены, зиготены, пахитены и диплотены, которые завершаются формированием ооцита I порядка. Завершается процесс роста ооцита I порядка стадией вителлогенеза с формированием ооцита II порядка. Завершается процесс оогенеза периодом созревания, который осуществляется следующими друг за другом делениями. При первом делении формируется ооцит II порядка, содержащий практически все накопленные и необходимые для дальнейшего развития вещества, и малых размеров первичное направительное тельце. Второе деление приводит к образованию яйцеклетки из вторичного ооцита, сохраняющей все необходимые для развития нового организма вещества, и нового направительного тельца. Таким образом, из одного первичного ооцита в процессе созревания возникают только одна зрелая яйцеклетка и три направительных тельца.
Рост и созревание яйцеклетки происходит в фолликуле яичника. Фолликулярная жидкость является средой, содержащей смесь белков, метаболитов, ионов, а также других молекул, каждая из которых оказывает влияние на процесс гаметогенеза, дальнейшее оплодотворение и, как следствие, нормальный эмбриогенез. Паракринная связь между различными типами клеток через фолликулярную жидкость обеспечивает развитие зрелого ооцита, готового к оплодотворению. Точное понимание роли различных компонентов фолликула важно для решения ключевых репродуктивных проблем. Исследователи предположили, что микроРНК, которые содержатся в фолликулярной жидкости, могут потенциально участвовать в регуляции фолликулогенеза [26]. В 2017 г. Machtinger R. и соавт. обнаружили, что miR-320b, miR-720, miR-10b-3p, miR-126-5p, miR-30a-5p, miR-202-5p и miR-1274а [14] являются одними из наиболее представленных в фолликулярной жидкости, что соответствует результатам, опубликованным Sang и соавт. [27]. При этом внеклеточные микроРНК (miR-30d-5p, miR-320b, miR10b-3p, miR-1291 и miR-720) фолликулярной жидкости были ранее обнаружены в клетках гранулезы и клетках кумулюса [14], что является косвенным доказательством наличия межклеточной коммуникации в фолликуле яичника. В данном исследовании выявили различия в уровне экспрессии miR-130b и miR-92a в образцах фолликулярной жидкости, содержащей зрелый ооцит, по сравнению с таковыми, содержащими незрелую клетку (кратность изменения уровня экспрессии (КИ) составила 1,65 и 1,52 соответственно). Также было обнаружено, что экспрессия miR-202-5p (КИ =1,82; p=0,01), miR-206 (КИ=2,09; p = 0,04), miR-16-1-3p (КИ =1,88; p=0,05) и miR-1244 (КИ=2,72; p=0,05) была значительно выражена в фолликулах, ооциты которых обладали способностью к оплодотворению [14]. В проведенном исследовании выявили дифференциальную экспрессию внеклеточных микроРНК miR-663b (FC=0,18; p=0,02), miR-766-3p (КИ=1,95; p=0,01), miR-132-3p (КИ=2,45; p=0,05) и miR-16-5p (КИ=3,80; p =0,05) в фолликулярной жидкости в зависимости от качества получаемого после оплодотворения яйцеклетки эмбриона [14]. Примечательно, что спектр секретируемых в фолликулярную жидкость микроРНК, равно как и уровень их экспрессии, зависит от возраста организма. Например, da Silveira и соавт. [28] обнаружили, что разные стадии развития фолликула у молодых и пожилых кобыл различались по уровню экспрессии 26 и 53 микроРНК соответственно. И эти списки микроРНК были уникальны для данных возрастных групп. Уровень miR-181a был в 15 раз выше в фолликулярной жидкости преовуляторного фолликула, по сравнению с незрелым фолликулом в образцах молодых особей, в то время как уровень miR-181a не имел существенных различий на разных стадиях фолликулогенеза в образцах пожилых особей. В связи с тем, что исследователи выявили различия в уровне экспрессии miR-181 в фолликулярной жидкости молодых и пожилых особей, они предположили, что miR-181 играют важную роль в фолликулогенезе. Аналогично, в 2014 г. Diez-Fraile и соавт. [29] продемонстрировали различия в уровне экспрессии четырех микроРНК(miR-21-5p, miR-134, miR-190b и miR99b-3p) в фолликулярной жидкости в зависимости от возраста женщины. Эти данные свидетельствуют о возможном применении методов определения уровня экспрессии внеклеточных микроРНК фолликулярной жидкости для оценки качества ооцитов [28]. В связи с тем, что фолликулярное микроокружение, в котором развиваются ооциты, может влиять на дальнейшее развитие эмбриона [30], в некоторых исследованиях была предпринята попытка идентифицировать биомаркеры в фолликулярной жидкости, которые могли бы использоваться в качестве прогностических факторов развития эмбриона и исходов беременности [31–34]. В 2018 г. Jing Fu и соавт. [35] обнаружили, что уровень экспрессии miR-663b в фолликулярной жидкости определял дальнейшее формирование и созревание бластоцисты, а также ее морфологическую характеристику. Авторы работы пришли к выводу, что высокий уровень экспрессии miR-663b в фолликулярной жидкости может отражать нарушение процесса созревания ооцита. Также авторы исследования предположили, что miR-663b можно использовать в качестве маркера высокого потенциала развития эмбриона.
Данные исследования демонстрируют важную регуляторную роль микроРНК в созревании ооцита, его способности к оплодотворению и дальнейшем развитии эмбриона.
Дисрегуляция микроРНК как один из факторов мужского бесплодия
Сперматогенез является сложным процессом [36], который состоит из последовательных стадий: митотической пролиферации сперматогоний, мейотического деления и морфологической дифференциации предшественников сперматозоидов (спермиогенез), приводящей к образованию высокоспециализированных клеток, характеризующихся наличием головки, шейки, вставочной части, хвоста и концевой части аксонемы. В течение жизни плода сперматогенез начинается в стенке семенных канальцев из недифференцированных диплоидных клеток, известных как сперматогонии, которые подвергаются нескольким митотическим делениям с целью увеличения пула доступных предшественников половых клеток. В период полового созревания некоторые сперматогонии трансформируются в сперматоциты типа I, которые подвергаются первому мейотическому делению, продуцируя гаплоидные сперматоциты типа II. В этих клетках происходит второе мейотическое деление, образующее гаплоидные сперматиды. Последняя фаза сперматогенеза представлена спермиогенезом, характеризующимся морфологическим и структурным преобразованием клеток. Этот этап, происходящий без дальнейшего деления клетки, приводит к образованию высокоспециализированных клеток, характеризующихся наличием головки, шейки, вставочной части, хвоста и концевой части аксонемы.
Немаловажным в оценке фертильности супружеской пары является и анализ транскриптома во время сперматогенеза, чтобы соотнести возможные его изменения со специфическими формами мужского бесплодия [37]. Известно, что микроРНК по-разному экспрессируются на разных стадиях сперматогенеза и, в конечном итоге, отвечают за правильное формирование сперматозоидов [38]. Следовательно, микроРНК могут играть роль в этиологии субфертильности и мужского бесплодия. Чтобы понять роль микроРНК в различных формах нарушений сперматогенеза, профили экспрессии микроРНК были изучены в нормальных тканях яичка человека [39] и в яичках у мужчин c диагностированной азооспермией [40]. В ходе исследования были выделены несколько дифференциально экспрессированных микроРНК (hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-449a, hsa-miR-34b, hsa-miR-1274a, hsa-miR-125a-5p). Анализ микроРНК, выделенных из спермы, представляется более целесообразным для диагностических целей, чем анализ микроРНК, выделенных при исследовании биоптатов яичка, в связи с выраженной гетерогенностью образцов яичка [37]. В 2014 г. Salas-Huetos [41] и соавт. провели исследование в группе мужчин с нормальными показателями спермограммы, стандартным кариотипом и подтвержденной фертильностью. Результаты исследования продемонстрировали высокую гомогенность анализируемой популяции с точки зрения паттерна экспрессии микроРНК. Из 736 проанализированных микроРНК 221 микроРНК присутствовали во всех образцах. Исходя из ранее проведенных исследований, а также полученных данных, 18 микроРНК потенциально отвечают за сперматогенез (hsa-let-7a-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa- miR-26a-5p, hsa-miR30a-5p, hsa-miR-34b-5p, hsa-miR-34b-3p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-122- 5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-184, hsa-miR-193b-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-512-3p и hsa-miR-1275), 4 микроРНК связаны с созреванием сперматозоидов в эпидидимисе (hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR-892a и hsa-miR-892), а 4 микроРНК вносят вклад в эмбриональное развитие (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-150-5p и hsa-miR-372). В 2017 г. Shao-Qin Ge и соавт. [42] опубликовали исследование, в котором они изучали влияние микроРНК на сперматогенез. Уровень miR-34c-5p, miR-122, miR-146b-5p, miR-181a, miR-374b, miR-509-5p, и miR-513a-5p был значительно ниже у пациентов с азооспермией в образцах семенной плазмы, при этом уровень тех же микроРНК был значительно выше у пациентов с астенозооспермией по сравнению с нормозооспермией [43]. При этом значительное снижение уровня miR-449 в семенной плазме отмечалось при олигоастенотератозооспермии [44], а снижение уровня miR-122 отмечали при астенозооспермии или олигоастенозооспермии [45]. В семенной плазме пациентов с необструктивной азооспермией уровень miR-141, miR-429 и miR-7-1-3p был выше, чем у фертильных мужчин [46]. Некоторые из специфичных для сперматозоидов транскриптов передаются в ооцит при оплодотворении и играют важную роль в эпигенетической регуляции раннего эмбриогенеза [47, 48], в том числе путем контроля материнско-зиготического перехода и экспрессии эмбриональных генов [49]. Обнаружили, что miR-34c, которая является наиболее представленной микроРНК в сперматозоидах мужчин [38], также была выявлена в сперме и зиготах у мышей, у которых ингибирование miR-34c приводило к остановке раннего эмбрионального развития [50].
Таким образом, изменение профиля экспрессии мнРНК в сперматозоидах и в семенной плазме может привести к нарушениям сперматогенеза и к последующему аномальному развитию эмбриона.
Заключение
Выявление и изучение биомаркеров бесплодия на этапе гаметогенеза сможет привести к улучшению диагностики, тактики лечения и, в конечном итоге, исходов в репродуктивной медицине. Определение мнРНК у супружеских пар с идиопатическим бесплодием, возможно, поможет разобраться в причинах ненаступления беременности. Диагностика мнРНК в фолликулярной жидкости женщины и в эякуляте мужчины может стать достаточно эффективным индикатором качества ооцитов и сперматозоидов соответственно и их потенциала в формировании качественного эмбриона с дальнейшим развитием физиологической беременности. Таким образом, анализ профиля экспрессии мнРНК, регулирующих гамето- и эмбриогенез, с целью оценки фертильности супружеской пары чрезвычайно перспективен, актуален и современен и позволит значительно повысить эффективность программ ЭКО.
