Согласно определению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), бесплодие – это неспособность к зачатию более 12 месяцев регулярной половой жизни без контрацепции [1]. Частота бесплодия у супружеских пар детородного возраста колеблется от 10 до 20% и имеет тенденцию к дальнейшему росту [2]. Только в нашей стране зарегистрировано более 5 миллионов бесплодных супружеских пар, нуждающихся в использовании методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Использование методов ВРТ позволило добиться значительных успехов за последние 30 лет, однако, несмотря на достижения в этой области, частота наступления беременности и живорождения остается недостаточно высокой. Поэтому повышение эффективности методов ВРТ является актуальной задачей для множества специалистов, занимающихся лечением бесплодия.
Даже перенос морфологически качественного эмбриона в полость матки, в которой эндометрий структурно соответствует фазе менструального цикла, не всегда приводит к развитию желанной беременности, а наступившая беременность в ряде случаев прерывается на ранних сроках развития [3]. По данным литературы, частота прерывания беременности, наступившей в результате ЭКО, колеблется от 15 до 20%, из них 70–80% приходится на I триместр беременности [4].
Более 30% пациенток в программе ЭКО составляют женщины с повторными неудачами имплантации. Это может быть связанно с качеством эмбриона, сниженной рецептивностью матки и несостоятельностью сигнальных процессов или молекулярных коммуникаций между эмбрионом и эндометрием [5, 6].
Многократные неудачные попытки ЭКО, самопроизвольные аборты, неразвивающиеся беременности в анамнезе – все это является сложным психоэмоциональным, финансовым и физическим испытанием для супружеских пар [5, 7].
Имплантация эмбриона – сложный многоступенчатый процесс с вовлечением большого числа клеточных и гуморальных факторов, а также каскада разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий [7–12].
В программах ВРТ после оплодотворения in vitro яйцеклетки сперматозоидом эмбрионы развиваются в культуральных средах, от которых в значительной степени зависит их жизнеспособность. Совершенствование состава сред и протоколов последовательного культивирования эмбрионов, произошедшее в течение последних десятилетий, позволило осуществлять более длительное культивирование эмбрионов, а именно до 5-х суток, стадии бластоцисты [13–15]. Однако, современная система культивирования эмбрионов человека все еще субоптимальна и только 40–60% эмбрионов развиваются до стадии бластоцисты. Качество сред для культивирования и их состав могут существенно улучшить шансы эмбрионов для полноценного развития. Так, одним из подходов является добавление в культуральную среду цитокинов и факторов роста, присутствующих в репродуктивном тракте, что может способствовать нормализации процесса роста и развития эмбриона. В частности, добавление в культуру гранулоцитарно – макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) ускоряет развитие эмбриона, повышает процентную долю ранних дроблений, которые приводят к появлению бластоцисты, повышает их внутриклеточную массу и снижает активность процессов апоптоза [7, 8, 10, 12, 16, 17].
Цитокины и хемокины играют значительную роль в иммунологической адаптации и процессе перестройки тканей, важном для возникновения и развития беременности [17, 18].
GM-CSF – полипептидный цитокин, состоящий из 127 аминокислот с двумя участками гликозилирования. GM-CSF оказывает свое действие на клетки-мишени посредством взаимодействия с высокоаффинным, гетеродимерным рецепторным комплексом, включающим α- и β-субъединицы, принадлежащие рецепторам суперсемейства гематопоэтинов. Указанная α-субъединица (GM-CSFRα или CD116) входит в состав только GM-CSFR и связывает лиганды с низкой аффинностью. Субъединица β- (GM-CSFRβ или CD131) также входит в состав рецепторов интерлейкина-5 (ИЛ-5) и интерлейкина-3 (ИЛ-3). В результате рекрутинга в рецепторный комплекс GM-CSFR она трансформирует низкоаффинное взаимодействие в высокоаффинное, что в конечном итоге приводит к изменениям экспрессии генов клеткой-мишенью за счет запуска каскада внутриклеточных реакций, опосредованных JAK/STAT (Янус-киназа), MAPK (передатчик сигнала и активатор транскрипции) и фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3-K) [19]. Данные рецепторы обнаруживаются на мембране эмбриональных клеток уже на стадии 2-х бластомеров [20].
Экспрессия GM-CSF происходит в эпителиальных клетках, выстилающих фаллопиевы трубы и матку. GM-CSF продуцируется на протяжение всего менструального цикла, однако, значительное повышение его продукции наблюдается во время секреторной фазы менструального цикла и совпадает со временем имплантации эмбриона. Его синтез главным образом регулируется стероидными гормонами яичников и агентов-сигнализаторов, поступающих из семенной жидкости, а также ооцитом и формирующейся зиготой [21].
В 2012 Ziebe S. с соавторами провели рандомизированное, многоцентровое, плацебо-контролируемое, двойное слепое проспективное исследование, посвященное культивированию эмбрионов в среде, содержащей в своем составе GM-CSF в программах ВРТ. В исследование были включены 1332 пациентки. Проводилась стандартная программа ЭКО/ИКСИ. Культивирование эмбрионов осуществляли в классической среде без добавления GM-CSF (контрольная группа) и с добавлением GM-CSF (исследуемая группа). При этом концентрация сывороточного альбумина человека (ЧСА), добавляемая в среды, была различна: у 620 пациенток она составила 2 мг/мл, у 529 женщин – 5 мг/мл. Оценка эмбрионов проводилась в фиксированные моменты времени: 1 ч после оплодотворения, далее через 20, 27, 44, 68 часов, перенос осуществлялся на 3 сутки развития. Сравнительный анализ эффективности показал, что культивирование эмбрионов в среде с добавлением GM-CSF привело к увеличению частоты имплантации по сравнению с контролем, которая составила 23% против 20%, соответственно. Затем в обеих средах была изменена концентрация ЧСА с 2 мг/мл до 5 мг/мл, что привело к увеличению частоты имплантации в контрольной группе с 20% до 22,4 %, при этом не было отмечено разницы в частоте имплантации в группе исследования, в которой она составила 23,9% и 23%. Не было никакой разницы в количестве эмбрионов развившихся до 3-х суток – 42,0% (GM-CSF) против 43,9% (контрольной), а так же эмбрионов высокого качества 15,6% (GM-CSF) против 16,8% (контрольной). Вместе с тем, частота прогрессирующей клинической беременности (12 нед. гестации) была достоверно выше в исследуемой группе по сравнению с контрольной и составила 23,0 % против 18,7 %, при этом с низкой концентрацией ЧСА (2 мг/мл) для GM-CSF группы составила 23,5% против 16,7% в контрольной группе, а с высокой концентрацией ЧСА (5 мг/мл) она составила 22,4% (ГМ-КСФ) и 21,1% (контроль). Сравнительный анализ развития эмбрионов исследуемой группы показал, что оплодотворение, культивирование и перенос эмбрионов у пациенток с предыдущими неудачными попытками ВРТ в анамнезе увеличивает частоту наступления клинической беременности по сравнению с контролем (24,5% против 17,0%, соответственно). Данное исследование продемонстрировала эффективность культивирования эмбрионов до 3-х суток в среде, содержащей в своем составе GM-CSF [22].
В 2014 году Tevkin S. с соавторами провели сравнительный анализ эффективности культивирования эмбрионов человека в среде, содержащей GM-CSF по частоте наступления клинической беременности (ЧНБ), имплантации и ранних потерь беременности у женщин с предыдущими неудачными попытками ЭКО в анамнезе. В исследовании были проанализированы данные 197 циклов стимуляции пациенток, проходивших лечение в рамках программ ЭКО/ИКСИ. Число циклов в исследуемой группе составило 46, в контрольной – 151. Различий по возрасту, клинико-анамнестическим данным и показаниях для использования методов ВРТ в обеих группах выявлено не было. Сравнительный анализ эффективности показал, что культивирование эмбрионов женщин с предыдущими неудачными попытками ВРТ в среде с добавлением GM-CSF увеличивает частоту наступления клинической беременности по сравнению с контролем и составляет 39,1% против 27,8%, соответственно. При этом было отмечено, что частота имплантации и прогрессирующих клинических беременностей (12 нед. гестации) были достоверно выше в группе культивирования эмбрионов в среде с добавлением GM-CSF по сравнению со стандартной комбинацией сред и составили 20,4 и 17,4% против 11,6 и 9,1%, соответственно.
Авторы данной статьи полагают, что добавление GM-CSF в среды для культивирования эмбрионов позволяет увеличить ЧНБ и ЧИ у пациенток с предыдущими неудачными попытками ВРТ [23].
В 2016 году Zhou W. с соавторами провели ретроспективное когортное исследование. В исследование было включено 212 пациенток старше 35 лет. Проводилась стандартная стимуляция в программе ЭКО/ИКСИ. Далее пациентки были разделены на 2 группы: группа А из 117 женщин, эмбрионы которых культивировались в среде, содержащей GM-CSF и группа В из 95 женщин, которым культивировали эмбрионы в классической среде. Оценка эмбрионов проводилась по морфологическим критериям в фиксированные моменты времени: 17, 44, 68, 116 и 140±1 ч после оплодотворения двумя профессиональными клиническими эмбриологами.
Существенных различий в частоте дробления (96,2 против 96,5%) и формирования бластоцисты (53,2 против 54,0%) между GM-CSF и контрольной группами обнаружено не было. Однако, средний возраст женщин в группе GM-CSF (38,41±3,13 года) был на 1 год больше, чем в соответствующей контрольной группе (37,45±2,74 года) (P<0,05). Переносы в цикле стимуляции были проведены у 117 пациентов, из них у 67 пациентов эмбрионы культивировались в классической среде и у 104 с добавлением GM-CSF. Не было существенной разницы в количестве перенесенных эмбрионов (2,30±0,76 против 2,42±0,75), частоте имплантации (26,6 против 23,4%) и прогрессирующих клинических беременностей (37,3 против 38,5%) между контрольной группой и GM-CSF группой [24].
В ранее опубликованном сравнительном анализе, в котором были проанализированы данные 425 циклов пациенток в возрасте 26–46 лет, проходивших лечение в рамках программ ЭКО/ИКСИ [14]. Женщины в зависимости от возраста были разделены на две группы: 1-я – ≤34 и 2-я – ≥35. Число циклов в исследуемой группе (GM-CSF) составило 71, в контрольной – 354. Эффективность культивирования эмбрионов в среде с добавлением GM-CSF у женщин 1-й исследуемой и контрольной групп по ЧНБ и ЧИ отличались незначительно и составили 33,3% (5/16) и 14,7% (5/34) против 35% (47/143) и 17,2% (53/308) соответственно. Анализ эффективности культивирования эмбрионов в среде GM-CSF у пациентов 2-й (старшей) возрастной группы показал, что ЧНБ и ЧИ в группе GM-CSF были выше и составили 32,7% (18/55) и 17,2% (22/128) против 25,5% (56/220) и 10,6% (62/601) в группе контроля. Таким образом, культивирование эмбрионов пациенток старше 35 лет в среде с добавлением GM-CSF увеличивало ЧНБ по сравнению с контролем и составило 32,7% против 25,5% [25].
Морфологическая характеристика эмбриона, в том числе по классификации Гарднера Д., остается одним из основных методов оценки его качества в практике ЭКО/ИКСИ, которая недостаточно отражает зрелость эмбриона и позволяет только выделять когорту потенциальных эмбрионов для дальнейшего культивирования [26]. Определение физиологии эмбриона должно быть быстрым, точным и неинвазивным. Анализ культуральной среды представляет собой отличный источник материала для неинвазивной оценки жизнеспособности эмбриона [27, 28]. В последние годы встречается все больше исследований, направленных на изучение метаболизма эмбрионов, культивированных в лабораторных условиях, для выявления их связи с морфологией и потенциалом к имплантации. В основном внимание сосредоточено на метаболизме аминокислот, глюкозы и пирувата [27, 29–31].
В одной из работ Robertson S. с соавторами изучили влияние GM-CSF на развитие предимплантационных эмбрионов мышей [13]. Инкубация бластоцисты с рекомбинантным GM-CSF вызывала 50% увеличение поглощения неметаболизируемого аналога глюкозы – 3-О-метил глюкозы.
Таким образом, эти данные указывают на то, что при опосредованном связывании GM-CSF с низкоаффинными рецепторами происходит увеличение потребления глюкозы и повышение пролиферации и/или жизнеспособности бластомеров.
Быстрый скрининг метаболизма глюкозы эмбрионом человека на 5 и 6 сутки развития может быть информативным показателем при разработке алгоритма селективного отбора эмбриона для переноса в программах ВРТ.
Кроме того, наблюдающаяся связанная с полом разница в метаболизме мужских и женских человеческих эмбрионов подтверждает гипотезу о том, что существование в предимплантационном периоде в течение ограниченного времени двух активных Х хромосом и измененного протеома приводят к метаболическим различиям между женскими и мужскими эмбрионами [27].
Таким образом, использование среды, содержащей GM-CSF для культивирования эмбрионов in vitro, может создать условия для получения эмбрионов лучшего качества, увеличения частоты наступления беременности, предотвращения ее прерывания и рождения здоровых детей в программах ВРТ.
В большинстве ранее опубликованных исследований с использованием среды, содержащей в своем составе GM-CSF, эмбрионы культивировали до 3 суток. Однако, наличие бластоцист на 5 сутки культивирования облегчает отбор морфологически качественных эмбрионов, для селективного переноса 1-го эмбриона и снижения частоты развития многоплодной беременности.
С учетом актуальности данного вопроса в нашем центре начато исследование по изучению эффективности культуральной среды, содержащей в своем составе GM-CSF для пациенток с наличием в анамнезе не менее 2 неудачных попыток ЭКО при переносе бластоцист хорошего качества, биохимических и неразвивающихся беременностей в I триместре. Кроме того, проводится определение изменений содержания компонентов культуральных сред (классической и с применением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора), а именно глюкозы и глутамата, эмбрионами 5 суток развития с изучением ассоциации исследуемых показателей с качеством эмбрионов и исходами программ ВРТ.
