В последнее десятилетие развитие молекулярных технологий дало возможность изучать внутреннюю среду матки – спектр белков и метаболитов, микробиом эндометрия и его значение для организма человека-хозяина. Предполагается присутствие микроорганизмов в нормальном эндометрии для обеспечения иммунологического барьера в полости матки и формирования иммунологической толерантности к эмбриону, участия в создании «окна имплантации» [1–5]. Однако знания о микробиоме эндометрия, с одной стороны, дополняются новыми данными, с другой стороны, для оригинальных исследований отсутствуют унифицированные методологии; группы обследованных малочисленны и разнородны; образцы эндометрия получены разными способами, не исключающими возможную контаминацию [5–14].
В обзор включены опубликованные исследования, вошедшие в базу данных PubMed/MedLine, eLibrary за период 2019–2024 гг. Настройка фильтров – полный свободный текст, последние 5 лет. Поиск выполняли по ключевым словам endometrium microbiota/microbiom и завершили 21.03.2024. В обзор включено 32 источника, соответствующие критериям поиска.
Методы идентификации микроорганизмов
Предполагается, что из-за крайне низкой микробной биомассы в полости матки микробиологические методы идентификации не эффективны. В настоящее время для исследования микробиома, в том числе в эндометрии используются методы детекции, основанные на секвенировании (Next-Generation Sequencing, NGS) целевых генов или полного генома микроорганизмов (метагеномный анализ), экспрессия РНК. Анализ функциональной активности микроорганизма показывает способность к транскрипции РНК (транскриптомика), продукции протеинов (протеомика) и метаболитов (метаболомика). Для рутинного использования эти методы не применимы из-за их сложной воспроизводимости, трудоемкости, высокой стоимости.
Ген 16S рибосомальной РНК (рРНК) является филогенетически старым у бактерий, имеет участки с разной вариабельностью и присутствует у всех прокариот. На знании этого свойства основана идентификация микроорганизмов путем NGS гена 16S рРНК путем классификации микроорганизмов на группы по наблюдаемым признакам, возникшим в процессе эволюции. Числовые алгоритмы вычисляют кластеры вариантов со сходной последовательностью гена 16S с порогом идентичности 97%, что относится к таксону на уровне рода или вида, но не обязательно совпадает с таксоном культивируемых микроорганизмов [7]. Поэтому для обозначения кластера со сходной последовательностью, близкого к одному таксону, приняли термин «оперативная таксономическая единица» (Operational Taxonomic Unit, OTU). При этом математически рассчитанное число OTU не идентично разнообразию видов или родов [15]. Разные штаммы одного вида микробов могут иметь отличия последовательности гена, или хромосома может иметь копии гена 16S, что интерпретируется как завышенное видовое разнообразие [8, 16]. Виды бактерий могут иметь одинаковый признак и математически объединяться в один кластер, что количественно уменьшает видовое разнообразие. Для описания разнообразия микроорганизмов вычисляют относительную численность (relative abundance) OTU, равную доле (%) отдельного OTU в общей численности OTU в биотопе. Более точно идентифицировать виды и штаммы микроорганизмов возможно при помощи полного метагеномного анализа, но данная технология требует большого количества ДНК, очищенной от ДНК человека-хозяина, работы с большим массивом информации с применением биоинформатики и биостатистики [3].
Жизнеспособность и функциональную активность микроорганизмов определяют по способности транскрипции РНК с ее последующим секвенированием (метатранскриптомный анализ) и по уровню экспрессии генов [12]. Однако виды микроорганизмов имеют отличающуюся скорость транскрипции или могут иметь сходную функциональную активность, что влияет на оценку количества транскрипта [15]. Экспрессия протеинов и образование метаболитов также характеризуют функциональную активность микроорганизмов. Один из методов протеомного анализа – времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) отражает специфичность микроорганизмов в среде обитания [10, 17–19]. Метаболомный анализ определяет метаболиты методами жидкостной или газовой хроматографии, масс-спектрометрии, ядерного магнитного резонанса. Интерпретация результатов затруднена из-за высокого разнообразия метаболитов и скорости их продукции, присутствия метаболитов человека-хозяина. Общие ограничения метагеномного, метатранскриптомного, протеомного и метаболомного методов: высокая стоимость, работа с большим массивом данных, необходимость наличия эталонных и справочных баз данных.
В большинстве оригинальных публикаций о микробиоме эндометрия использован метод NGS участков V1-V9 c различной вариабельностью 16S гена рРНК [5, 7, 9, 11, 13, 20–26]. Для обозначения сообщества микроорганизмов, представляющих совокупность биотопов, населяющих организм человека, используется термин «микробиота». Поскольку современные методы идентификации микроорганизмов основаны на молекулярных технологиях, и результаты исследований описывают совокупность генов микробиоты организма-хозяина, их обозначают термином «микробиом».
Присутствие микроорганизмов в полости матки
Получить образец ткани эндометрия для его исследования возможно лишь с использованием инвазивного метода по медицинским показаниям, что делает крайне затруднительным исследование эндометрия у здоровых женщин. Наиболее репрезентативны исследования эндометрия у женщин репродуктивного возраста без патологии матки, подвергающихся вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ). Так, Ersahin S. et al. (2022) исследовали частоту колонизации бактериями полости матки культуральным методом у пациенток с бесплодием, подвергшихся переносу эмбриона, в зависимости от уровня антимюллерова гормона (АМГ) в крови и показали отрицательную корреляцию. При значениях АМГ<1,3 нг/мл рост бактерий получен в 8 случаях из 15 (53,3%), при AMГ 1,3–2,6 нг/мл – в 5 из 15 (33,3%), тогда как при АМГ>2,6 нг/мл позитивный результат сопоставим с группой фертильных женщин – 3 из 15 (20%) и 4 из 22 (18,1%) [2]. NGS 16S рРНК в 336 образцах аспирата из полости матки и 296 биоптатов эндометрия 342 пациенток, подвергшихся ВРТ, идентифицировали OTU в 208 (61,9%) и 190 (64,2%) образцах соответственно. В позитивных образцах наиболее часто выявлены роды бактерий Lactobacillus, Anaerococcus, Atopobium, Bifidobacterium, Corynebacterium, Gardnerella, Haemophilus, Microbacterium, Prevotella, Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus. В ткани эндометрия Lactobacillus отрицательно коррелировал с Gardnerella, Bifidobacterium, Atopobium. Из выявленных 22 таксонов 12 присутствовали в образцах двух типов, однако 3 таксона были уникальными для аспирата (Streptomyces, Clostridium, Chryseobacterium), а 7 присутствовали только в ткани эндометрия (Cupriavidus, Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Finegoldia, Micrococcus, Tepidimonas). Благоприятные исходы ВРТ связаны с наличием Cupriavidus, Finegoldia, Microbacterium, Tepidimonas в полости матки [24].
Lin Q. et al. (2023) исследовали микробиом эндометрия методом NGS гена 16S рРНК после лапароскопической гистерэктомии у 53 пациенток, из которых 15 образцов оказались негативными. В 38 ПЦР-позитивных случаях, куда вошли 21 женщина с диагностированным аденомиозом и 17 без аденомиоза и воспаления (контроль), всего обнаружили 24 типа, 651 род и 1931 вид микроорганизмов; причем в контрольных образцах имелось большее α-разнообразие микробиома с доминированием Vibrio metschnikovii по отношению к каждому из идентифицированных видов, тогда как при аденомиозе доминировал вид Lactobacillus iners [9].
Антибактериальная активность среды в полости матки может косвенно отражать ее микробиоту. Протеомный анализ аспирата из полости матки с последующим исследованием антимикробной активности выделенных пептидов проведен совместно в Научно-технологическом парке Бискайя и в Университете Страны Басков (Испания). Пациентами были 11 женщин, обследованных в отделении репродукции человека, в возрасте 27–39 лет, без воспалительных гинекологических заболеваний в анамнезе и с исключенной патологией матки. Методом масс-спектрометрии в 11 образцах аспирата из полости матки выявлено всего 4694 белка, в каждом из образцов – от 3642 до 1740 белков, причем 921 белок присутствовал во всех образцах и 2261 белок был идентифицирован в более 50% образцов. С использованием каталогов белков были идентифицированы 314 эксклюзивных белков эндометриальной жидкости. Антимикробную активность 7 выбранных пептидов протестировали по отношению к 13 микроорганизмам, в которые вошли 3 вида кандид, 6 аэробных и 4 анаэробных бактерий: Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilus, Gardnerella vaginalis, Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus anaerobius. Антимикробное действие отсутствовало в отношении C. albicans, K. pneumoniae, L. acidophilus, G. vaginalis, B. fragilis, P. anaerobius [17].
Доминируют ли Lactobacillus в эндометрии?
Результаты ряда исследований показывают доминирование рода Lactobacillus в эндометрии подобно биотопу влагалища [6, 22, 25]. На этом основании делают вывод о восходящем механизме колонизации полости матки, однако не исключают загрязнение материала при получении образцов эндометрия вагинальным доступом [6, 10].
В исследовании Canha-Gouveia A. et al. (2023) секвенировали 16S рРНК в образцах эндометрия, полученных через шейку матки при хирургической стерилизации 5 фертильных женщин без фоновой патологии, в 4 случаях доминировали Lactobacillus [7]. Секвенирование 16S рРНК из промывной жидкости, полученной путем лаважа полости матки, одновременно с диагностикой хронического эндометрита иммуногистохимическим методом у 130 бессимптомных пациенток с бесплодием обнаружило при эндометрите (12 из 130) относительную численность Lactobacillus 1,89% против 80,7% (P=0,034) без эндометрита. Исключительно при нормальном эндометрии обнаружены 13 OTU, включая 4 вида Lactobacillus: L. delbrueckii, L. coleohominis, L. mucosae, L. antri. Только при хроническом эндометрите (ХЭ) присутствовали Acinetobacter; также для ХЭ свойственна высокая численность таксонов Dialister, Bifidobacterium, Prevotella, Gardnerella, Anaerococcus [13]. Lüll K. et al. (2022) также исследовали микробиом эндометрия с одновременным иммуногистохимическим исследованием эндометрия для оценки содержания CD 138 в качестве маркера ХЭ у 25 бесплодных женщин. ХЭ установлен у 12 из 25 пациенток, однако особенностей микробиома авторы не обнаружили. При этом NGS 16S рРНК подвергли пары образцов аспирированной жидкости из полости матки и биоптат эндометрия. Всего было обнаружено 58 родов в ткани эндометрия и 43 рода в жидкости из полости матки, из которых наиболее распространен был род Lactobacillus. Авторы обозначили Lactobacillus доминирующим родом при относительной численности Lactobacillus ≥50%, что выявлено в 13 (52%) образцах ткани эндометрия и в 20 (80%) образцах жидкости. Наряду с Lactobacillus наиболее распространенными были роды Enterococcus, Gardnerella, Streptococcus, Escherichia–Shigella, Cutibacterium [21].
Fujii S. и Oguchi T. (2023) делают вывод о симбиозе микроорганизмов и эндометрия на основании исследования микробиома матки и рецептивности эндометрия у женщин, подвергшихся переносу криоконсервированного эмбриона на фоне заместительной гормональной терапии в программе ВРТ. С применением NGS и коммерческого набора EndomeTRIO (Испания) в биоптате эндометрия 185 пациенток 25–47 лет оценивали рецептивность эндометрия по экспрессии 248 генов; одновременно с этим проводили метагеномный анализ микробиома эндометрия с учетом этиологических возбудителей ХЭ. Относительно окна имплантации авторы классифицировали эндометрий как рецептивный или пререцептивный и обнаружили, что рецептивный эндометрий связан с более молодым возрастом пациенток (36,0±0,5 против 38,2±0,5 года, р=0,002) и паттерном микробиома. Рецептивный эндометрий характеризовался доминированием Lactobacillus >90% и отсутствием бактериальных патогенов у 27,9% против 12,2% образцов пререцептивного эндометрия, а также сверхнизкой биомассой микроорганизмов у 22,5% против 41,9% (р=0,007) [3]. Vanstokstraeten R. et al. (2023) исследовали с применением культуромики, MALDI-TOFMS и NGS 16S рРНК попарно материал, полученный из влагалища, и биоптаты эндометрия, взятые при диагностической гистероскопии у 10 субфертильных пациенток 30–44 лет. Все исследуемые образцы эндометрия содержали микроорганизмы; причем в 10 образцах эндометрия всего обнаружено 56 видов, из которых 43 были обнаружены также и во влагалище, но о количественном соотношении культуромика данных не дает. Тринадцать видов, идентифицированных только в эндометрии, относились к родам Campylobacter, Mobiluncus, Nannizzia, Ralstonia, Stenotrophomonas, Varibaculum. Во влагалищных образцах идентифицировали 90 видов микроорганизмов, что значимо больше, чем в эндометрии (p=0,002). Одновременно во влагалище и в эндометрии были обнаружены Lactobacillus 5 видов: L.gasseri, L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.vaginalis; только во влагалище обнаружена L.oris [10].
Reschini M. et al. (2022) сравнили микробиом влагалища и эндометрия 53 женщин с бесплодием, подвергшихся переносу криоконсервированных эмбрионов, когда критериями исключения из данного исследования были признаки воспалительных заболеваний, патология матки, применение гормональных средств. Из образцов вагинального отделяемого и эндометрия, полученного двухпросветным катетером, выделяли ДНК бактерий для последующей мультиплексной ПЦР и NGS 16S рРНК. Основной находкой стало несовпадение наиболее распространенных и доминирующих OTU на уровне родов во влагалище и эндометрии. Преобладание Lactobacillus обнаружено в 29 (55%) образцах влагалища и 16 (30%) образцах эндометрия, из которых в 14 случаях Lactobacillus преобладали в обоих типах образцов. Относительная численность Lactobacillus превышала 90%, что классифицировали как Lactobacillus-доминирование, лишь в 4 (8%) образцах эндометрия и в 22 (42%) вагинальных образцах. Кроме того, были установлены таксоны в эндометрии Pelomonas (N=4,8%), Pseudomonas (N=3,6%), Propionibacterium (N=2,4%), Escherichia/Shigella (N=4,8%), Streptococcus (N=1,2%), во влагалище Gardnerella (N=8,15%), Bifidobacterium (N=7,13%) [5].
Результаты NGS гена 16S рРНК для оценки микробиома эндометрия у 20 бесплодных женщин с многократными неудачными попытками ВРТ и у 15 фертильных здоровых женщин сравнили Баринова В.В. и соавт. (2021). У здоровых женщин относительная численность Lactobacillus составила 29,4%, что не отличалось от пациенток с бесплодием – 33,3%. Вместе с тем в нормальном эндометрии значимо выше относительная численность Acidovorax, Brevibacillus, Caulobacter, Comamonas, Delftia, Distigma, Pseudomonas, Schlegelella, Thermus, в то время как при бесплодии отмечена наибольшая численность Brevundimonas и Ralstonia [26].
Проспективное многоцентровое обсервационное исследование с участием 342 пациенток, подвергшихся ВРТ в 13 медицинских центрах Европы, Америки и Азии, дает противоречивое заключение. С одной стороны, репродуктивные исходы ВРТ были сходными и при наличии микробиома эндометрия, и при его отсутствии – с использованием секвенирования гена 16S рРНК не установлено какого-нибудь клинически значимого микроорганизма, связанного с неудачами ВРТ; с другой стороны, присутствие в большом количестве Lactobacillus в эндометрии увеличивает шансы живорождения [24]. Chen W. et al. (2021) по результатам NGS 16S рРНК 63 образцов аспирата из полости матки не выявили связи присутствия Lactobacillus с наступлением клинической беременности после ЭКО как при подтвержденном ХЭ, так и без него. При этом относительная численность Lactobacillus в полости матки была невысокой и составила при ХЭ и наступившей беременности 19,56%, при ХЭ без беременности – 25,28%, без ХЭ – соответственно 21,08% и 31,53%; из Lactobacillus чаще выявлен вид L. iners [23].
В Испании впервые с помощью нового метатранскриптомного подхода проведено картирование функционально активной микробиоты эндометрия здоровых женщин [12]. Были исследованы парные образцы эндометрия, взятые в пролиферативную фазу (6–8-й день цикла) и секреторную фазу (7–9-й день после пика лютеинизирующего гормона) у 7 женщин в возрасте 21–34 лет. Всего в эндометрии обнаружено 5326 транскрипционно активных микроорганизмов, из которых 85% отнесены к бактериям, 10% – к грибам, 5% – к вирусам, 0,3% – к археям. Данные результаты не подтвердили доминирование Lactobacillus в нормальном эндометрии; большинство идентифицированных микроорганизмов имели относительную численность ниже 1%, среди них относительно многочисленными явились Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Clostridium botulinum, Pasteurella multocida subsp. multocida, Hydrogenophaga sp. NH-16. Из общего числа идентифицированных 5326 живых микроорганизмов для 33 видов показаны различия в динамике менструального цикла. Для анализа связи метаболических путей было выполнено сравнение транскриптома хозяина и метатранскриптома микроорганизмов и установлено, что в секреторной фазе маточного цикла функционально обогащены 9 метаболических путей у человека-хозяина и 6 – у микроорганизмов, из которых 3 одинаковых – биосинтез простаноидов C20 (PWY66-374), деградация серотонина (PWY-6313), деградация L-триптофана (PWY-6307) [12]. В опыте in vitro в культуре клеток decidua, полученных с внешнего слоя плодных оболочек и схожих с функциональным слоем эндометрия, продемонстрирована возможность Lactobacillus прикрепляться к клеткам, давать рост колоний, образовывать биопленки. При этом Lactobacillus не индуцировали продукцию интерлейкина-10 в культуре клеток и не влияли на экспрессию митоген-активируемой протеинкиназы p38 (MAPKp38). Эти результаты не подтвердили предположение об опосредованном участии Lactobacillus в индукции сигнальных молекул, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировке, апоптозе клеток и продукции цитокинов [27].
Сравнительный анализ методов исследования эндометрия
Традиционный культуральный метод, основанный на фенотипической идентификации микроорганизмов, трансформировался в новое направление, получившее название «культуромика». Культуромика включает выращивание и изоляцию культуры микроорганизмов с последующим применением молекулярных и/или протеомных методов исследования. Последовательно внедрялись методы: ПЦР для генотипирования, количественная ПЦР, секвенирование нового поколения, секвенирование гена 16S рРНК, метагеномный анализ, времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией. С 2012 г., когда был внедрен данный исследовательский подход, было идентифицировано более 1000 видов, ассоциированных с человеком, включая 247 новых видов [19]. Однако и эти новые высокопроизводительные методы имеют ограничения. NGS 16S рРНК применимо для прокариот, идентифицирует микроорганизмы по принципу таксономической принадлежности и без учета их метаболической активности [12, 15]. Результаты метагеномного, протеомного, метаболомного анализа нужно сопоставлять с имеющейся базой референсных данных.
Исследуемый материал и способ его получения могут значительно влиять на результат изучения микробиома матки [7, 9, 11, 24]. Искажение результатов возможно из-за контаминации испытуемых образцов при их получении, что может быть исключено фоновым контролем загрязняющей ДНК [24] или моделированием контроля загрязнения in silico [7]. В отрицательном контроле при NGS 16S рРНК обнаружены и признаны контаминантами 15 таксонов бактерий Acidovorax, Acinetobacter, Chryseobacterium, Citrobacter, Elizabethkingia, Escherichia, Flavobacterium, Janthinobacterium, Leptothrix, Methylobacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Yersinia [20].
Использование катетера для переноса эмбриона [2, 5, 25] также как использование промывных вод [13] не предполагает получение ткани эндометрия. При получении образцов эндометрия вагинальным доступом нельзя исключить контаминацию образцов микроорганизмами влагалища и шейки матки, когда Lactobacillus spp. доминируют в обоих биотопах [6, 7, 25]. Разночтения вносят различающиеся критерии доминирования Lactobacillus; большинство авторов обозначали Lactobacillus доминирующими при 90% или более от общей бактериальной нагрузки [3, 5, 20, 24], тогда как отдельные авторы полагали обозначать доминирующими, если их численность была >50% [21].
Единичные работы содержат данные о микробиоме эндометрия здоровых женщин, так как для получения образца ткани необходимо инвазивное вмешательство [7, 12, 17, 26, 28]. Поэтому в качестве репрезентативных учитывают результаты исследований микробиома эндометрия бесплодных женщин без фоновой патологии, так как эти пациентки имеют основания для исключения ХЭ, и процедура ВРТ включает выполнение внутриматочных манипуляций [2, 3, 20, 24, 25, 29]. При этом ХЭ диагностирован у более четверти пациенток с бесплодием [20, 23]. Крупное исследование, проведенное в клинике репродукции Осака (Япония) в период 2010–2020 гг. с участием 3449 пациенток, подтвердило ХЭ по данным иммуногистохимии у 31,4%, из которых 7,8% были с множественно-лекарственной устойчивостью (МЛУ) к антибиотикотерапии. Кроме того, авторы обнаружили, что в первые 5 лет десятилетнего периода исследования МЛУ составляла 1,3%, а во второе пятилетие – 9,6%. По результатам NGS 16S рРНК у пациенток с ХЭ микробиом влагалища и эндометрия не зависел от чувствительности или устойчивости к антибиотикам [20].
Данные о наличии и составе микробиоты эндометрия нормальной матки противоречивы [26, 30–32]. Проспективное многоцентровое обсервационное исследование, проведенное в 13 медицинских центрах на трех континентах, показало отсутствие микробиома в аспирате из полости матки и в ткани эндометрия у более 40% женщин, родивших живых детей после ВРТ. При этом по результатам NGS в позитивных образцах выявлены OTU, признанные контаминантами или потенциально не колонизирующими человека; к позитивным отнесены 15 OTU из эндометриальной жидкости и 19 из ткани эндометрия, 12 OTU были найдены в образцах обоих типов [24].
Метатранскриптомный анализ эндометрия здоровых женщин установил 3 основные новые позиции: 1) эндометрий в норме обладает очень низкой микробной биомассой с живыми микроорганизмами без доминирования Lactobacillus; 2) состав микробиома эндометрия отличается в пролиферативную и секреторную фазы маточного цикла; 3) микроорганизмы эндометрия обладают возможной метаболической активностью, связанной с метаболической активностью клеток хозяина [12].
Заключение
В настоящее время знания о микробиоме нормального эндометрия находятся в состоянии накопления новых данных. Побудительными мотивами для исследования микробиома эндометрия являются предположения об участии микроорганизмов в метаболических, иммунных процессах, обеспечивающих имплантацию бластоцисты. Современные методы идентификации микроорганизмов основаны на молекулярных технологиях, из которых в научных исследованиях наиболее применимо секвенирование следующего поколения гена 16S рРНК. Данный метод высокочувствительный и способен выявить присутствие микроорганизмов с очень низкой биомассой в исследуемом образце, но по этой же причине может быть получен позитивный результат при контаминации очень малым количеством загрязняющей ДНК.
Значительным ограничением в исследовании микробиома эндометрия является затруднение в способе получения биологического образца из полости матки здоровой женщины. Доступ через влагалище и цервикальный канал имеет высокий риск контаминации, и, возможно, с этим связаны полученные данные о присутствии в эндометрии и доминировании Lactobacillus, подобно их доминированию во влагалище в норме. Вместе с тем треть тестируемых биологических образцов из полости матки остается без идентифицированных микроорганизмов, а в позитивных образцах эндометрия выявляют высокое видовое разнообразие микроорганизмов с относительной численностью большинства из них ниже 1%. Также противоречивы данные о связи присутствия Lactobacillus в эндометрии и их относительной численности в эндометрии с наступлением клинической беременности, живорождением после применения ВРТ. Для повышения точности результатов исследований микробиома эндометрия необходимо создание протокола, регламентирующего критерии исключения пациенток, способ получения и тип биологического образца, метод учета результата с определением наименьшей относительной численности таксона.
