Известно, что запуск цитокинового каскада, который включает продукцию интерферонов (ИФН), про- и противовоспалительных цитокинов, а также цитокинов Th1- и Th1-2 типов лежит в основе иммунопатогенеза многих вирусных инфекций. Следует ожидать, что баланс между цитокинами различных оппозиционных групп во многом будет определять характер развития иммуного ответа против вирусов папилломы человека (ВПЧ) и индуцированных ими предопухолевых и опухолевых заболеваний шейки матки. Установлено, что смещение цитокинового профиля в сторону преимущественной продукции цитокинов Th1-типа – ИФН-γ и интерлейкина-2 (ИЛ-2) имеет принципиальное значение для становления эффективной иммунной защиты при папилломавирусной инфекции (ПВИ), поскольку клеточный иммунитет играет ключевую роль в контроле роста ВПЧ-трансформированных клеток [1, 3–5]. Вместе с тем на экспериментальных моделях показано, что если защитная роль провоспалительных цитокинов проявляется локально в очаге воспаления, то их системная гиперпродукция не только не приводит к развитию эффективного противоинфекционного иммунитета, но и может усилить рост ВПЧ-индуцированных опухолей [5, 12]. Поэтому для понимания механизмов малигнизации ВПЧ-инфицированных клеток чрезвычайно важными является исследование связи между характером течения заболевания и изменением продукции цитокинов различных оппозиционных групп, регулирующих, прежде всего, развитие как воспалительной реакции, так и клеточного звена иммунитета.
В связи с этим целью работы являлось определение продукции ИФН, других провоспалительных, а также противовоспалительных цитокинов и числа лимфоцитов различных функциональных субпопуляций у больных ВПЧ-индуцированной дисплазией шейки матки.
Материал и методы исследования
Обследованы 54 женщины (средний возраст 26,5 года) с ВПЧ-индуцированной дисплазией шейки матки. Из них с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями (ЦИН) I степени – 19, II степени – 15, III степени и cancer in situ – 20 человек. В контрольную группу были включены 10 клинически здоровых женщин того же возраста. При диагностике ПВИ использовали комплексный метод исследования – в материале шейки матки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли ДНК ВПЧ, а также специфические цитоморфологические, гистологические и кольпоскопические маркеры ВПЧ-пораженных тканей [7, 9, 11]. В сыворотке периферической крови определяли концентрацию ИФН-γ, ИФН-α, ИЛ-1β, -2, -4, -10 и фактора некроза опухоли α (ФНО-α) методом иммуноферментного анализа с использованием тестсистем фирмы Procon (Санкт-Петербург). Число
Т-лимфоцитов и их отдельных субпопуляций исследовали с помощью моноклональных антител к CD3+, CD4+, CD8+ (Becton-Dickinson, США) и CD3+/HLARD+ (Immunotech, Франция) антигенам. Подсчет клеток, а также анализ результатов проводили на цитофлуориметре FACStar Plus (Becton-Dickinson, США). Все полученные цифровые данные обрабатывали с помощью компьютерной программы Epi Info (версия 6.0) методом вариационной статистики с использованием критерия Фишера.
Pезультаты исследования
В материале шейки матки больных ЦИН І–III и cancer in situ в большинстве случаев идентифицировали ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска – ВПЧ-16 и -18, реже – ВПЧ-31 и -33. Специфическими цитологическими маркерами заболевания являлись койлоциты, дискератоциты, двухъядерные, а также многоядерные и гигантские клетки; гистологическими – койлоцитарная атипия и патологические митозы. В отличие от ЦИН І и II в гистологических препаратах больных ЦІН ІІІ и cancer in situ атипические клетки выявлялись по всей толщине ВПЧ-пораженного эпителиального пласта.
Установлено, что при ЦИН І и II в периферической крови число лейкоцитов, а также лимфоцитов различных функциональных субпопуляций, в том числе отражающих состояние иммунодефицита (CD3+, CD4+, CD8+ и CD3+/HLA-DR+Т-лимфоцитов), оказалось в границах принятой нормы (табл. 1).
Таблица 1. Число Т-лимфоцитов и их отдельных субпопуляций в периферической крови больных
дисплазией шейки матки, (M±m).
Наблюдалась тенденция к снижению иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, но разница по сравнению с показателями контроля была недостоверной. Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных ЦИН III и cancer in situ обнаружили уменьшение числа CD3+/HLA-DR+ Т-лимфоцитов, тогда как число лейкоцитов и Т-лимфоцитов других функциональных субпопуляций сохранялось на уровне нормы. Обращает на себя внимание то, что у этих больных снижался иммунорегуляторный индекс CD4/CD8 относительно показателей в контроле.
У больных ВПЧ-индуцированной дисплазией шейки матки изменялась продукция ИФН и других провоспалительных, а также противовоспалительных цитокинов, анализ соотношения которых позволяет охарактеризовать направление развития иммунного ответа в сторону преимущественного становления клеточных (Th1-путь) или гуморальных (Th2-путь) реакций. Так, наблюдалось существенное понижение концентрации сывороточных ИФН-α и -γ (табл. 2).
Таблица 2. Концентрация цитокинов в сыворотке крови больных дисплазией шейки матки, (M±m).
Следует отметить, что уровень ИФН-α в сыворотке крови был снижен независимо от степени выраженности дисплазии: концентрация этого цитокина у больных ЦИН III и cancer in situ не имела принципиального отличия от показателей больных ЦИН І (p>0,05) или ЦИН II (p>0,05). Вместе с тем в группе больных ЦИН III и cancer in situ отмечен наиболее низкий уровень сывороточного ИФН-γ (p<0,05).
При ВПЧ-индуцированной дисплазии шейки матки продукция цитокинов, вовлеченных в развитие как ранней, так и поздней фазы воспалительной реакции, наооборот, возрастала. Показано, что повышение степени тяжести заболевания сопровождалось возрастанием концентрации ФНО-α в сыворотке крови. У больных ЦИН І уровень сывороточного ФНО-α не отличался от контрольного, тогда как при ЦИН II, ЦИН III и cancer in situ – повышался.
Концентрация ФНО-α в сыворотке крови была наибольшей при ЦИН III и cancer in situ (p<0,05). Продукция ИЛ-1β и ИЛ-2 увеличивалась независимо от степени выраженности дисплазии, что подтверждалось повышением концентрации этих цитокинов в сыворотке крови больных как ЦИН І, так и ЦИН II, ЦИН III и cancer in situ. При ЦИН III и cancer in situ уровень сывороточного ИЛ-1β незначительно снижался (p<0,05) по сравнению с ЦИН І и II, но оставался повышенным относительно показателей контроля. Концентрация цитокинов Th2-типа в сыворотке крови больных ВПЧ-индуцированной диспплазией шейки матки изменялась следующим образом. Независимо от степени выраженности дисплазии уровень ИЛ-10 в сыворотке крови снижался относительно показателей в контроле. Продукция ИЛ-4, наооборот, резко возрастала. У больных ЦИН І в 40 и 60% случаев наблюдалось повышение уровня этого цитокина в сыворотке крови соответственно до 5,65±0,95 (p<0,05) и 28,73±5,53 (p<0,05) пкг/мл против 0,32±0,02 пкг/мл в контроле. При ЦИН II концентрация сывороточного ИЛ-4 возрастала до 10,98±3,09 (p<0,05) и 32,43±3,60 (p<0,05) пкг/мл
соответственно в 27 и 73% случаев. Повышение содержания этого цитокина в сыворотке крови
больных ЦИН III и cancer in situ до 19,32±3,42 (p<0,05) и 44,18±6,38 (p<0,05) пкг/мл отмечено соответственно в 38,5 и 61,5% случаев.
Результаты проведенных нами исследований показали, что при ВПЧ-индуцированной дисплазии шейки матки изменялся цитокиновый профиль организма – снижалась системная продукция ИФН различных типов, но усиливалась продукция других провоспалительных цитокинов – ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-2, тогда как продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 оказалась существенно сниженной. Повышение продукции ИЛ-4 при одновременном нарушении γ-интерфероногенеза, более выраженном
при ЦИН III и cancer in situ, свидетельствует об угнетении развития клеточного иммунного ответа Th1-типа. Наблюдаемое снижение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, а также числа CD3+/HLA-DR+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных ЦИН III и cancer in situ можно рассматривать как подтверждение развития дисфункции клеточного звена иммунитета при более тяжелой степени выраженности дисплазии.
Обсуждение
Известно, что цитокины различных оппозиционных групп, прежде всего про- и противовоспалительные цитокины, играют ключевую роль в реализации взаимодействия ВПЧ с эпителиальными клетками слизистой оболочки шейки матки [1, 3, 6]. Поэтому влияние ВПЧ на продукцию цитокинов [3] является одним из важнейших механизмов ускользания этих вирусов от воздействия факторов иммунитета. Прежде всего, обращает на себя внимание то, что онкобелки Е6 и Е7 ВПЧ, с которыми связан онкогенный потенциал этих вирусов, супрессируют экспрессию генов ИФН-α и -γ, а также продукцию
ИЛ-18, регулирующего γ-интерфероногенез. В то же время, известно [3], что ИФН-α и -γ оказывают прямое противовирусное действие в отношении ВПЧ и снижают антипролиферативную активность ВПЧ-трансформированных клеток, угнетая экспрессию онкогенов Е6 и Е7.
Ранее нами было установлено, что у больных ЦИН I–III и cancer in situ понижалась способность клеток периферической крови к продукции ИФН-α и -γ in vitro в ответ на адекватную индукцию, что позволяет предполагать подавление противовирусного звена иммунитета, тогда как при ВПЧ-индуцированных доброкачественных процессах шейки матки она сохранялась на уровне контроля (клинически здоровых лиц) [2, 8]. Полученные нами данные показали, что при ВПЧ-индуцированной дисплазии ПВИ шейки матки также угнеталась системная продукция ИФН-α и -γ, о чем свидетельствует снижение концентрации этих цитокинов в сыворотке крови. Супрессия α-интерфероногенеза при
одновременном повышении продукции ИЛ-4 подтверждает данные литературы [3] о сдвиге при ПВИ цитокинового профиля в сторону преимущественной продукции цитокинов Th2- типа. Скорее всего иммунодевиация Th2-клеток может быть следствием супрессивного влияния онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ на α-интерфероногенез, что и приводит к повышению продукции ИЛ-4, угнетающего в свою очередь Th1-клетки и развитие иммунного ответа по клеточному типу. Снижение числа CD3+/HLA-DR+ Т-лимфоцитов в периферической крови и иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 подтверждает наличие дисфункции клеточного звена иммунитета у больных ЦИН III и cancer in situ, в сыворотке крови которых коцентрация ИФН-γ была ниже, чем у больных ЦИН I и ЦИН II. Можно утверждать, что нарушение продукции ИНФ, в первую очередь γ-интерфероногенеза, лежит в основе перехода вирусной инфекции в хроническую форму, способствует ее персистенции и злокачественному прогрессированию, поэтому играет важную роль в малигнизации патологического процесса. Это также подтверждается связью между полиморфизмом генов ИФН-α и развитием ПВИ шейки матки [3]. Именно поэтому применение препаратов интерферона или его индукторов для коррекции состояния иммунной системы у больных ВПЧ-индуцированной дисплазией шейки матки может быть более эффективно, чем использование других иммуномодулирующих препаратов.
Прогностически неблагоприятным признаком течения ПВИ следует признать нарушение равновесия между продукцией про- и противовоспалительных цитокинов. Как показали результаты проведенных нами исследований, в сыворотке крови больных ВПЧ-индуцированной дисплазией шейки матки на фоне резко сниженной концентрации ИЛ-10 резко возрастал уровень ФНО-α и ИЛ-1β. Высокая концентрация ИЛ-1β обнаружена [10] также в плазме крови больных ВПЧ-индуцированным цервикальным раком. Следует отметить, что риск развития этого заболевания ассоциировался с полиморфизмом генов ИЛ-1β [10], а также ФНО-α [3]. Совершенно неожиданным оказалось установленное нами повышение концентрации сывороточного ИЛ-2. Из данных литературы следует, что у больных ПВИ шейки матки
продукция этого цитокина клетками периферической крови в ответ на индукцию специфическими антигенами ВПЧ, наоборот, снижалась [3]. Не исключено, что повышение уровня сывороточного ИЛ-2 при ЦИН І–II, ЦИН III и cancer in situ является следствием неспецифической стимуляции клеток-продуцентов этого цитокина при развитии ВПЧ-индуцированной дисплазии шейки матки.
Таким образом, изучение цитокинового профиля организма и показателей клеточного иммунитета при ПВИ шейки матки имеет большое значение для прогнозирования характера развития иммунного ответа на ВПЧ, а также позволяет создать новые, научно обоснованные подходы к его регуляции путем целенаправленного воздействия в первую очередь на продукцию цитокинов различных оппозиционных групп и восстановление их равновесия. Это является перспективным направлением дальнейших исследований.
