В рамках программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при культивировании эмбрионов in vitro, часто наблюдается их атипичное развитие. Появление плеоморфной популяции цитоплазматических фрагментов под zona pellucida является общей чертой ранних эмбрионов. У более чем 50% получаемых in vitro эмбрионов человека можно наблюдать присутствие цитоплазматической фрагментации, то есть наличие в перивителлиновом пространстве эмбриона фрагментов бластомеров различного размера, не содержащие ядра или содержащих фрагменты ядерного материала. Наблюдения показали, что наличие фрагментации часто сопровождается другими аномалиями в развитии, такими как мультиядерность бластомеров, дезорганизация и несоответствие размеров бластомеров стадии развития эмбриона, уменьшение межклеточной адгезии, увеличение толщины zona pellucida.
У эмбрионов человека, полученных посредством ЭКО, фрагментация была впервые описана в 1970 г. [1], однако этот феномен не является уникальным ни для метода ЭКО, ни для эмбрионов человека. Данное явление было описано как у эмбрионов человека, развивающихся in vivo [2–5], так и у эмбрионов практически всех видов млекопитающих, развивающихся в условиях как in vivo, так и in vitro.
Давно известно, что фрагментация эмбрионов человека ассоциирована со снижением их жизнеспособности [6] и представляет собой большую проблему в рамках повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Причины возникновения фрагментации и ее влияние на жизнеспособность эмбриона являются актуальными вопросами как биологии развития, так и практической репродуктивной медицины.
Феномен фрагментации эмбрионов
В 70-х гг. прошлого века Эдвардс при in vitro культивировании эмбрионов человека наблюдал явление, которое он описал как «деление клеток без деления ядра» [1]. Этот феномен наблюдался как у развивающихся, так и у остановившихся в развитии эмбрионов.
В редких случаях фрагментация может возникать на стадии зиготы, перед сингамией, и связана с зиготической/эмбриональной остановкой в развитии. Значительная часть эмбрионов, подвергшихся фрагментации на стадии пронуклеусов, останавливаются в развитии на 1–2-й день либо становятся чрезмерно фрагментированными на 3-й день и непригодными ни для переноса эмбриона, ни для криоконсервации [7]. Цитоплазматическая фрагментация является наиболее распространенной аномалией развития эмбрионов человека, развивающихся in vitro.
Таким образом, фрагментация – это явление, в результате которого образуется плеоморфная популяция безъядерных/микроядерных/мультиядерных, ограниченных оолеммой цитоплазматических структур предимплантационного эмбриона, обнаруживаемых в перивителлиновом пространстве между бластомерами или между бластомерами и zona pellucida.
Фрагментация в условиях in vivo
Фрагментация не является феноменом, наблюдаемым исключительно в условиях in vitro. Эмбрионы различных видов животных, включая приматов и сельскохозяйственных животных, полученные in vivo, также могут быть фрагментированы.
Является ли фрагментация эмбрионов человека столь же распространенным явлением in vivo, как и in vitro, пока неясно. Информация о морфологических особенностях эмбрионов человека, развивающихся in vivo, весьма ограничена. С середины прошлого века было проведено 3 значимых исследования, которые отвечают на некоторые вопросы относительно феномена фрагментации эмбрионов, полученных in vivo [2–4].
В исследованиях Hertig (1954) 4 эмбриона были оценены как аномальные. Помимо присутствия многоядерных бластомеров, при анализе тонких срезов эмбрионов авторы обнаружили в них признаки «клеточной дегенерации или некробиоза», что можно интерпретировать как наличие фрагментации [2].
Ortiz и Croxatto (1979) ассоциировали феномен цитоплазматической фрагментации со «старением» неоплодотворенного ооцита: фрагментация была зафиксирована у 42% неоплодотворенных яйцеклеток, полученных через 96 ч и более, после овуляторного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) у женщин, воздерживающихся от половых контактов. Они также обнаружили 25 аномальных яйцеклеток, полученных из половых путей женщин, у которых были половые контакты. Неясно, была ли фрагментация вызвана «старением» неоплодотворенного ооцита или произошла после оплодотворения [3].
В исследовании Buster et al. (1985) было обнаружено, что 4 яйцеклетки, полученные при лаваже матки через 100 ч и более после овуляции у фертильных доноров ооцитов были полностью интактными. Другие 15 эмбрионов содержали от 2 до 16 бластомеров. Один 6-клеточный эмбрион имел полностью интактные, хотя и неравного размера, бластомеры. Некротический дебрис содержался в перивителлиновом пространстве одного 2-клеточного эмбриона (возможно, вследствие лизиса одного из бластомеров). Другой эмбрион, оцененный как 14-клеточный с неравномерным дроблением, мог фактически содержать цитоплазматические фрагменты, однако сейчас это уже трудно установить [4].
В целом фрагментация присуща эмбрионам, полученным как in vitro, так и in vivo, однако она более часто встречается у эмбрионов, культивируемых в условиях in vitro. Возможно, условия in vitro и/или гиперстимуляция яичников более способствуют возникновению цитоплазматической фрагментации эмбрионов, нежели условия in vivo.
Ультраструктура цитоплазматических фрагментов
Фрагментация представляет собой несколько цитоплазматических фрагментов, которые не содержат полноценного ядра, но могут содержать хроматин. Сканирующая электронная микроскопия показала, что структура поверхности цитоплазматической мембраны данных объектов значительно отличается от таковой у нативных бластомеров. Поверхность нативных клеток покрыта микроворсинками определенной длины и плотности расположения, в то время как поверхность цитоплазматических фрагментов не имеет четкой структуры и покрыта микроскопическими шаровидными выпячиваниями (везикулами) [8].
За исключением отсутствия ядра, внутренняя организация цитоплазмы фрагментов и содержащиеся в ней органеллы могут соответствовать таковым у интактных бластомеров. В зависимости от происхождения и расположения цитоплазматические фрагменты могут содержать полный набор органелл, включая митохондрии, или могут быть практически полностью их лишены [9].
В исследованиях Halvaei et al. (2016), при использовании просвечивающей электронной микроскопии, было показано, что цитоплазматические фрагменты имели отчетливую сплошную мембрану с редкими микроворсинками. Внутри фрагментов обнаруживались различные цитоплазматические органеллы, среди которых митохондрии являлись наиболее многочисленными клеточными структурами. Митохондрии в основном были интактными, с умеренно электронно-плотным матриксом. В то же время наблюдались остаточные митохондриально-везикулярные комплексы, заполненные хлопьевидным и слабо электронно-плотным материалом. Такие комплексы являются типичными образованиями для ооцитов и зигот на стадии пронуклеусов. Кроме того, в цитоплазматических фрагментах были обнаружены мембранные структуры аппарата Гольджи. Иногда встречались фрагменты дегенерирующих митохондрий, небольшие прозрачные вакуоли и первичные лизосомы [10].
Цитоплазматические фрагменты имеют отчетливую и неповрежденную мембрану с остаточным количеством микроворсинок оолеммы. При образовании больших фрагментов (до 45 мкм в диаметре на 2-й день и до 40 мкм – на 3-й день развития эмбриона) бластомер/ы теряют значительный объем цитоплазмы, содержащей органеллы (митохондрии), мРНК и белки, что в результате может приводить к задержке в развитии эмбриона [11]. Обнаружение большого числа интактных митохондрий во фрагментах позволяет предположить, что они обладают ферментативной активностью [11]. Количество и форма митохондрий также зависели от дня развития эмбриона, причем митохондрии становились более многочисленными и удлиненными в бластомерах эмбриона, по мере прогрессирования деления дробления [12].
Однако Chi et al. (2011), оценивая ультраструктуру фрагментированных эмбрионов при помощи просвечивающей электронной микроскопии, обнаружили уменьшение числа митохондрий в безъядерных цитоплазматических фрагментах по сравнению с нормальными бластомерами, что может свидетельствовать об истощении запасов аденозинтрифосфата (АТФ) во фрагментах и приводить к их лизису [13]. Также присутствие небольших вакуолей и первичных лизосом во фрагментах, наряду с наличием дегенерирующих митохондрий с расширенными кристами и измененными мембранами, можно считать ультраструктурными маркерами ранней дегенерации [10].
Используя цейтраферную фотосъемку, Hardarson et al. (2002) сообщили, что некоторые фрагменты способны лизировать либо быть повторно включены в состав бластомеров [14]. Крупные фрагменты могут сначала увеличиваться в размере с образованием более прозрачной цитоплазмы, а затем в результате разрыва цитоплазматической мембраны содержимое фрагмента попадает в перивителлиновое пространство. Мелкие апикальные фрагменты также способны к разрушению. Предполагается, что лизис отдельных фрагментов может быть обусловлен истощением в них запасов АТФ в связи с отсутствием или дисфункцией митохондрий [9].
Слияние цитоплазматических фрагментов с бластомерами также является достаточно частым явлением. Hardarson et al. (2002) сообщили, что из трех фрагментов, которые появились во время первого деления на поверхности одного бластомера двухклеточного эмбриона, один фрагмент в течение нескольких минут полностью инкорпорировался, и его содержимое стало частью содержимого бластомера [14]. Сканирующая электронная микроскопия показала, что между такими фрагментами и бластомерами имеются цитоплазматические мостики (сталки), которые обеспечивают цитоплазматическую непрерывность между фрагментом и бластомером [9].
Причины и механизмы возникновения фрагментации
Предпосылки возникновения фрагментации могут лежать в области, связанной как с самим эмбрионом, так и с пациентом, от которого они получены [9, 15]. Причины фрагментации эмбрионов человека остаются до конца не изученными, однако ряд факторов может оказывать влияние на ее возникновение, в том числе: нарушения фолликулогенеза вследствие индукции суперовуляции, неблагоприятные условия культивирования эмбрионов in vitro, субоптимальный состав сред для культивирования, активные формы кислорода, апоптоз и онкоз бластомеров, хромосомные нарушения [16–20].
Индукция суперовуляции. Гиперстимуляция яичников и созревание ооцитов в условиях «экстремального» роста множества фолликулов могут способствовать возникновению фрагментации эмбрионов. Сообщалось, что гиповаскуляризация и возникающая вследствие этого гипоксия растущих фолликулов приводят к повышению частоты возникновения цитоплазматических и хромосомных нарушений в ооцитах, а впоследствии – к снижению жизнеспособности эмбрионов [16]. Однако явление фрагментации присуще не только эмбрионам, полученным в программах индукции суперовуляции, после введения экзогенных гонадотропинов. Эмбрионы, полученные в естественных нестимулированных циклах, также демонстрируют цитоплазматическую фрагментацию как в легкой, так и в тяжелой форме [21], но, очевидно, общим для обеих групп является воздействие на эмбрионы неблагоприятных факторов при культивировании in vitro.
Условия культивирования. На развитие эмбрионов, помимо непосредственного состава среды, значительное влияние оказывают условия культивирования in vitro. Например, внеклеточный водородный показатель pH [22] и температура [17] могут повлиять на жизнеспособность эмбрионов путем воздействия на их цитоскелет. Снижение водородного показателя pH культуральной среды ниже 6,5–6,7 приводит к дестабилизации клеточных мембран посредством ингибирования полимеризации актина [23].
Аналогичным образом было показано, что высокое содержание кислорода в газовой среде (20% O2) приводит к накоплению активных форм кислорода в бластомерах и может приводить к повреждению клеточных мембран, вызывая апоптоз и фрагментацию, чего не наблюдалось при культивировании in vivo или в трехкомпонентной газовой смеси с пониженным содержанием кислорода (5% O2) [20].
Хромосомные нарушения. Анеуплоидии и структурные хромосомные нарушения обнаруживаются как в женских, так и в мужских гаметах [24]. Данные хромосомные аномалии не препятствуют оплодотворению, однако могут приводить к фрагментации эмбрионов и остановке их в развитии. Было обнаружено, что достаточно большая доля сильно фрагментированных эмбрионов является анеуплоидными.
Pellestor et al. (1994) исследовали кариотипы 118 эмбрионов, содержащих бластомеры разного размера и имеющих большую долю фрагментаций [18]. Диплоидный набор хромосом был обнаружен только у 12% исследованных эмбрионов, у остальных были обнаружены различные хромосомные нарушения, такие как анеуплоидии и мозаицизм. Munne et al. (1995) на 154 остановившихся в развитии и/или фрагментированных эмбрионах применили метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием зондов к хромосомам X, Y, 18 и 13/21 [25]. Хромосомные нарушения, обнаруженные в этой группе эмбрионов, включали обширный мозаицизм, анеуплоидии и полиплоидии.
В дальнейших исследованиях было показано, что 66% интактных бластомеров эмбрионов, имеющих фрагментацию более 35%, являются хромосомно-аномальными [26]. Несмотря на то что у сильно фрагментированных эмбрионов доля хромосомных нарушений значительно возрастает, у эмбрионов с фрагментацией менее 35% доля хромосомных нарушений составляет 47%. Полученные данные также указывают, что больше половины всех фрагментированных эмбрионов являются генетически нормальными.
Апоптоз. Обновление пула клеток в организме является перманентным процессом, который включает в себя не только пролиферацию и дифференциацию клеток, но также уничтожение и утилизацию поврежденных клеток. Этот процесс называется апоптозом, или запрограммированной гибелью клеток. Апоптоз отличается от другой формы гибели клеток – некроза, который возникает в результате повреждения и обычно затрагивает целые клеточные популяции [27].
Соматическая клетка в ранней стадии апоптоза характеризуется рядом морфологических изменений, таких как изменение формы и объема клетки, потеря поверхностных структур, конденсация хроматина в ядре и диссоциация ядрышек, фрагментация ядра, конденсация цитоплазмы и формирование апоптотических телец [28].
В связи с морфологическим сходством между апоптозом соматических клеток и цитоплазматической фрагментацией предимплантационных эмбрионов, а также доказательством запрограммированной гибели клеток в бластоцистах млекопитающих [29] было выдвинуто предположение, связывающее процесс апоптоза и раннюю фрагментацию бластомеров в эмбрионе [19]. Это предположение основывалось на результатах исследования по окрашиванию остановившихся в развитии фрагментированных эмбрионов методом TUNEL, для выявления конденсации и деградации хроматина [19]. Впоследствии Levy et al. (1998) утверждали, что использование только одного метода TUNEL не позволяет отличить апоптоз от некроза и использовали окрашивание методом TUNEL в комбинации с маркированием аннексина V для обнаружения клеток на ранних стадиях апоптоза [30]. Все остановившиеся в развитии или фрагментированные эмбрионы человека окрашивались положительно на аннексин V, в то время как развивающиеся эмбрионы не демонстрировали такого окрашивания [31].
Однако имеются данные, опровергающие роль апоптоза в процессе фрагментации бластомеров. Van Blerkom et al. (2001) показали, что окрашивание методом TUNEL и маркирование аннексина V не могут надежно свидетельствовать о факте гибели клеток, так как нормальные транскрипционно-активные ядра могут быть TUNEL-положительными, а в случае гибели клеток окрашивание аннексина не может конкретно указывать на форму клеточной гибели, поскольку клетки, подвергающиеся некрозу или лизису, также окрашиваются положительно на аннексин V. Van Blerkom et al. (2001) окрашивали фрагментированные эмбрионы не только методами TUNEL и на присутствие аннексина V, но и проводили анализ методом Comet для выявления повреждения ДНК [9].
Положительная TUNEL-флуоресценция и Comet-окрашивание были обнаружены только во вторых полярных тельцах, а также у эмбрионов с лизисом клеток или в случае фрагментации ДНК, экспериментально индуцированной обработкой ДНК-азой. Все зафиксированные эмбрионы показали положительное окрашивание на аннексин V. Впоследствии было указано на ошибочно сделанный вывод в исследовании Levy et al. (1998), согласно которому предполагалось, что зафиксированные эмбрионы окрашиваются по аннексину V не по причине фиксации клеток, а в результате их апоптоза [31].
Онкоз. Van Blerkom et al. (2001) предложили альтернативную гипотезу возникновения фрагментации, согласно которой ведущую роль в формировании фрагментации играет не апоптоз, а факторы цитоплазмы. Было выдвинуто предположение, что процесс, схожий с онкозом, может являться основным механизмом фрагментации эмбрионов человека [9]. Онкоз представляет собой ряд потенциально обратимых событий в соматической клетке, происходящий в условиях гипоксии и дефицита АТФ и приводящий к гибели клеток [32]. Во время онкоза также наблюдается значительное изменение клеточной мембраны, напоминающей фрагментацию. Van Blerkom et al. (2001) утверждают, что причиной такого процесса может быть временный и/или локальный дефицит АТФ в бластомерах ранних эмбрионов человека, возникающий из-за непропорционального распределения митохондрий в бластомерах [9]. Это предположение основано на наблюдении, что у зиготы а также в бластомерах ранних эмбрионов значительные кортикальные области цитоплазмы могут быть лишены митохондрий [33]. Дефицит митохондрий может привести к снижению содержания АТФ в бластомере и нарушить механизм поддержания целостности клеточной мембраны, что в итоге приведет к фрагментации.
Фрагментация, грануляция и клеточный дебрис
Клеточный дебрис под zona pellucida является одним из экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов млекопитающих и встречается приблизительно у 10% ооцитов человека [34]. Грануляции в перивителлиновом пространстве могут возникать по разным причинам, включая экзоцитоз кортикальных гранул, большие дозы гонадотропинов в цикле стимуляции ЭКО, большой возраст женщины и нарушения в строении блестящей оболочки [34, 35].
Присутствие значительного количества грануляций и клеточного дебриса в перивителлиновом пространстве также рассматривается как морфологический дефект эмбриона. Грануляция может возникнуть из остатков цитоплазматических мостиков между ооцитом и клетками corona radiata [36]. Более того, предполагается, что грубая грануляция может возникнуть из клеток кумулюса, попавших в перивителлиновое пространство при формировании zona pellucida [35]. Экстрацитоплазматические фрагменты, такие как попавшие в перивителлиновое пространство кумулюсные клетки, также могут нарушать процесс вылупления. Кроме того, наличие таких фрагментов может являться причиной снижения результативности программ ЭКО [36, 37].
Морфологическая оценка фрагментации в эмбрионе
Наряду с количеством и размером бластомеров, в качестве важного морфологического критерия, позволяющего оценить жизнеспособность эмбриона, проводится оценка наличия фрагментации, степени ее выраженности и локализации.
Основываясь на относительном размере популяции фрагментов, наблюдаемой при микроскопии, некоторые исследователи оценивают степень фрагментации субъективно (от небольшой до значительной) [6, 38].
В качестве более объективной оценки степени фрагментации, в зависимости от протоколов клинических лабораторий ЭКО, может быть использована числовая (например, от 1 до 4) или буквенная оценка (например, от А до D). Такие системы оценки являются более удобными и информативными, так как каждому символу соответствует числовое значение степени фрагментации, выраженное в процентах [39, 40].
У сильно фрагментированных эмбрионов часто бывает трудно отличить большие цитоплазматические фрагменты от бластомеров, поэтому для эмбрионов 2-го дня развития принято считать фрагментацией цитоплазматические компартменты менее 45 мкм в диаметре, а для эмбрионов 3-го дня развития – фрагменты <40 мкм в диаметре [11]. Наблюдения показали, что цитоплазматические фрагменты данных размеров не содержали ДНК. Кроме того, следует помнить, что при проведении оценки развития эмбрионов степень фрагментации может как увеличиваться, так и уменьшаться со временем, от одного наблюдения к другому.
Феномен уменьшения объема фрагментации связан с тем, что фрагменты, или цитоплазматические «пузыри», образующиеся во время дробления бластомеров, часто представляют собой вре́менные структуры, которые могут исчезать посредством обратной резорбции бластомерами или подвергаться лизису [9, 14].
Исследования с использованием цейтраферной фотосъемки показали, что фрагменты могут рециркулировать обратно в материнские бластомеры и исчезать при последующих циклах деления дроблением [10, 14, 41].
Влияние фрагментации на морфологию раннего эмбриона
Неравный размер бластомеров. Цитоплазматическая фрагментация может приводить к появлению в эмбрионе бластомеров разного размера. Также клетки неравного размера могут появиться в результате пропущенного цитокинеза в одном или нескольких бластомерах. В таком случае, если кариокинез действительно имел место, остановившиеся в развитии клетки могут оказаться многоядерными. Hardarson et al. (2001) обнаружили значительно более высокую частоту как многоядерности, так и анеуплоидий у эмбрионов с бластомерами разного размера [42]. Явная форма асимметрии бластомеров наблюдается в случае, когда в эмбрионе присутствует один большой бластомер и несколько более мелких. Большая клетка часто бывает многоядерной. Было установлено, что такие эмбрионы часто оказываются полиплоидными вследствие нарушения цитокинеза [43].
Многоядерность. Было показано, что на второй день развития у 2-клеточных эмбрионов мультинуклеация бластомеров встречается значительно чаще, чем у 4-клеточных эмбрионов [44]. Присутствие многоядерных бластомеров в эмбрионах 2, 3 и 4-го дня развития положительно коррелирует с частотой встречаемости мозаицизма и/или полиплоидии [45]. Однако в исследованиях Staessen и Van Steirteghem (1998) было обнаружено, что многоядерность бластомеров в некоторых случаях может быть вре́менной и обратимой [46].
Адгезия. Клеточная адгезия играет ключевую роль в морфогенезе раннего эмбриона. Экспрессия факторов клеточной адгезии частично зависит от контакта клеток между собой, поэтому степень контактного взаимодействия бластомеров внутри перивителлинового пространства влияет на развитие эмбриона. В случае наличия большого количества цитоплазматических фрагментов количество межклеточных контактов между бластомерами может быть снижено. Потеря клеточной адгезии может повлиять на ряд ключевых событий раннего развития эмбриона, в том числе на способность к компактизации, кавитации и образованию отдельных клеточных популяций трофэктодермы и внутренней клеточной массы.
Влияние степени фрагментации на жизнеспособность эмбриона и клинические исходы программ ЭКО
Ряд сообщений свидетельствует о снижении количества благоприятных исходов беременности при переносе эмбрионов с плохой морфологией [47, 48]. Сообщается, что в случае переноса эмбрионов 2-го [49] или 3-го [50] дня развития с высокой степенью фрагментации частота имплантации и наступления беременности снижена, особенно в случае, если объем фрагментации превышает 25% от общего объема эмбриона. Однако эмбрионы с незначительной степенью фрагментации (до 10%) имплантируются с той же частотой, что и эмбрионы без фрагментации [40, 49].
Antczak и Van Blerkom (1999) и Alikani et al. (1999) выдвинули предположение, что на жизнеспособность большее влияние оказывают не наличие фрагментации как таковой, а время ее образования и пространственная локализация фрагментов в дробящемся эмбрионе [7, 40].
Как правило, первоначальное образование фрагментации отмечается во время оценки оплодотворения (1-й день развития) и морфологической оценки развития эмбриона на стадии дробления (2–3-й дни развития). В случае, когда объем фрагментации значителен, обнаруживается лишь небольшое количество неповрежденных бластомеров. В случае если среди массы цитоплазматических фрагментов визуализируются единичные бластомеры, то такие эмбрионы обычно останавливаются в развитии в связи с активацией каскада апоптоза в бластомерах и гибели эмбриона [19, 31].
В исследовании Tan et al. (2019) было установлено, что эмбрионы с более высокой степенью фрагментации на 3-й день развития, при переносе бластоцист 5–6-го дня, полученных из этих эмбрионов, имеют более низкие показатели живорождения (81,4, 73,5, 60,7, 47,2, 31,6 и 12,8% при 0–5, 6–10, 11–15, 16–20, 21–25% фрагментации соответственно). Было обнаружено, что эмбрионы без фрагментации или со слабовыраженной фрагментацией с более высокой вероятностью разовьются до стадии бластоцисты; в то же время большая часть эмбрионов со значительной степенью фрагментации остановится в развитии после 3-го дня. В группах эмбрионов с различной степенью фрагментации не было обнаружено различий по таким показателям, как доля эуплоидных эмбрионов (67,29%), частота мозаицизма (8,89%) и доля анеуплоидных эмбрионов (25,09%). Перенос бластоцист, полученных из эмбрионов с более высокой степенью фрагментации на 3-й день, не показал какого-либо значительного снижения частоты имплантации [51].
Tan et al. (2019) утверждают, что степень фрагментации эмбриона на 3-й день развития влияет лишь на его способность развиться до стадии бластоцисты (из-за несоответствующего распределения клеток в перивителлиновом пространстве). Но в случае, если эмбрион развивается до стадии бластоцисты, то наличие фрагментации не оказывает никакого влияния на долю имплантации и не увеличивает вероятность возникновения хромосомных нарушений в таком эмбрионе. Данные подтверждаются сообщениями о получении беременности при переносе эуплоидных бластоцист с высокой степенью фрагментации [51].
В 2011 г. на международном форуме ученых в области репродуктивной медицины ALPHA специальной группой по вопросам эмбриологии ESHRE был опубликован документ, согласно которому фрагментация должна быть классифицирована как легкая, в случае если ее объем <10%; умеренная – 10–25% и тяжелая – >25% от объема эмбриона [52].
В случае, когда объем фрагментации превышает 25%, вероятность имплантации такого эмбриона и получения в данном цикле ЭКО беременности снижается. Снижение вероятности имплантации и наступления беременности, наблюдаемое после переноса эмбрионов на стадии дробления с наличием высокой степени фрагментации (>25%), вероятно, связано с тем, что такие эмбрионы при культивировании до стадии бластоцисты имеют сниженное количество клеток в трофэктодерме и внутренней клеточной массе. Напротив, у эмбрионов с фрагментацией до 25% наблюдается снижение числа клеток только в трофэктодерме [53]. Кроме того, доля анеуплоидий возрастает с увеличением степени фрагментации эмбрионов [54].
Было высказано предположение, что на жизнеспособность эмбриона влияет не только степень фрагментации, но и характер ее локализации [7, 40]. В случае, если цитоплазматические фрагменты равномерно распределены в перивителлиновом пространстве, жизнеспособность и вероятность к имплантации такого эмбриона будут меньше, нежели у эмбриона с аналогичной степенью фрагментации, но локализованной в одной области под zona pellucida [40].
Было отмечено, что вероятность возникновения хромосомных нарушений была выше у эмбрионов с диффузной фрагментацией, по сравнению с эмбрионами, у которых расположение фрагментов было локализованным [54]. Однако цейтраферная съемка развивающихся эмбрионов показала, что расположение фрагментации является динамическим явлением. Фрагменты могут перемещаться внутри перивителлинового пространства эмбриона, а иногда даже исчезать, подвергаясь обратной резорбции бластомерами.
Основываясь на этих данных, специалисты ALPHA и ESHRE пришли к выводу, что характер расположения цитоплазматических фрагментов не является значимым критерием и может не учитываться при морфологической оценке эмбриона [52].
Микрохирургическое удаление цитоплазматических фрагментов
Поскольку эмбрионы для переноса в полость матки отбираются на основании их морфологических особенностей, остается открытым вопрос о том, улучшается ли результативность ВРТ, если у эмбриона с большой долей фрагментации произвести удаление цитоплазматических фрагментов и дебриса из перивителлинового пространства. В результате проведения этой процедуры удается значительно улучшить показатель морфологической оценки качества эмбриона; то есть эмбрион с неудовлетворительной морфологической оценкой после удаления цитоплазматических фрагментов оценивается как эмбрион хорошего качества. Этот прием получил название дефрагментации, или косметической микрохирургии, и характеризуется удалением цитоплазматических фрагментов, клеточного дебриса и грубой грануляции из перивителлинового пространства эмбриона перед его переносом.
Halvaei et al. (2015) сообщили о получении ряда прогрессирующих клинических беременностей после переноса эмбрионов, подвергнутых процедуре дефрагментации у пациенток с рецидивирующими неудачными имплантациями в анамнезе [55].
Цитоплазматические фрагменты и значительная часть грануляций могут быть удалены из перивителлинового пространства на стадии дробления эмбриона, то есть до момента проведения переноса. В исследовании Halvaei et al. (2016) проводили косметическую микрохирургию эмбрионов на стадии дробления с целью удаления фрагментаций и грубой грануляции. Данные показали, что косметическая микрохирургия умеренно фрагментированных эмбрионов не улучшает исходы ВРТ в общей группе неотобранных пациентов после процедуры ИКСИ [10].
Теоретически удаление цитоплазматических фрагментов может увеличить жизнеспособность некачественных эмбрионов за счет улучшения межклеточных взаимодействий между бластомерами. Также оно может предотвратить возможное выделение токсичных веществ из фрагментов, что может привести к дегенерации или лизису интактных соседних бластомеров [40]. Считается, что удаление фрагментов из эмбрионов с фрагментацией до 15% или свыше 35% не приводит к каким-либо значимым улучшениям клинических исходов [56]. Alikani et al. (1999) подразделяли эмбрионы по их фрагментации на пять классов: I – менее 5% фрагментации, II – 6–15%, III – 16–25%, IV – 26–35% и V – более 35% соответственно. При ретроспективном анализе данных, полученных в результате переноса фрагментированных эмбрионов, было показано, что имплантация была значительно снижена при переносе эмбрионов, фрагментация которых превышала 15%, несмотря на удаление фрагментов до проведения переноса [40].
Хотя отсутствие фрагментации коррелирует с лучшими исходами, перенос эмбриона, фрагментация которого превышает 50%, приводит к значительному снижению частоты наступления беременности и высокому риску возникновения врожденных пороков развития [57]. Поэтому выполнение косметической микрохирургии для этих двух групп эмбрионов нецелесообразно, так как эмбрионы с менее чем 10% фрагментацией имеют аналогичную частоту имплантации и наступления беременности, что и эмбрионы без фрагментации. Кроме того, у сильно фрагментированных эмбрионов косметическая микрохирургия может, вероятно, только улучшить классификацию эмбрионов при оценке, но не увеличить потенциал развития эмбрионов.
Было показано, что существует отрицательная зависимость между уровнем фрагментации эмбрионов и долей образования бластоцист [58]. В проспективном исследовании Eftekhari-Yazdi et al. сообщалось, что удаление цитоплазматических фрагментов на стадии дробления эмбриона привело к улучшению качества бластоцист по сравнению с контрольной группой [59]. В исследовании Halvaei et al. (2016) было обнаружено, что бластоцисты могут быть получены после косметической микрохирургии эмбрионов с фрагментацией более чем 50% [10]. В ретроспективном исследовании Keltz et al. (2006) сообщалось, что частота имплантации, клинических беременностей, самопроизвольных абортов, живорождений и генетических дефектов плода в результате переноса «некачественных» эмбрионов после удаления фрагментов были аналогичны результатам после переноса эмбрионов «отличного» качества [60]. В этом исследовании авторы проводили удаление фрагментов только для эмбрионов с более чем 10% фрагментацией, но не указывали верхний предел фрагментации.
Однако в исследовании Sözen et al. (2012) было показано, что у пациентов моложе 39 лет, имеющих эмбрионы с фрагментацией от 10 до 20%, дефрагментация не улучшает показатели имплантации или живорождения. Они также сообщили, что частота встречаемости многоплодных беременностей и неонатальных аномалий были одинаковыми в контрольной и исследуемой группах [61].
Было найдено, что вероятность фрагментации эмбрионов увеличивается с возрастом женщины [60]. Вероятно, удаление цитоплазматических фрагментов из эмбрионов может благоприятно сказаться на исходах программ ЭКО у пациенток старшего репродуктивного возраста, но не улучшить клинические исходы у молодых пациенток с благоприятным прогнозом [40, 61]. Возможно, выполнение косметической микрохирургии оправдано в отдельных случаях и при определенных обстоятельствах, например, у пациенток с рецидивирующим отсутствием имплантации эмбрионов [55].
Ретроспективные исследования свидетельствуют о положительном эффекте дефрагментации, в то время как проспективные исследования не подтверждают этого положительного влияния на последующее развитие эмбрионов и показатели беременности. Результаты Halvaei et al. (2016) показали, что косметическая микрохирургия у эмбрионов с фрагментацией 10–50% не улучшает частоту наступления беременности у молодых пар пациентов с мужским фактором бесплодия в анамнезе [10].
Влияние удаления из эмбрионов цитоплазматических фрагментов на результативность ЭКО является спорным. Удаление фрагментов с помощью микрохирургической техники не может устранить первопричину возникновения фрагментации. Учитывая тот факт, что фрагменты содержат значительное количество клеточных органелл и способны к обратной резорбции, удаление фрагментов на ранних стадиях дробления может лишать бластомеры митохондрий и приводить к снижению продукции АТФ, необходимого для дальнейшего развития эмбрионов. Исследования по удалению фрагментов на более поздних стадиях развития эмбриона и его влиянию на клинические исходы программ ЭКО в литературе пока отсутствуют. Помимо этого, для быстрого и безопасного выполнения этой процедуры требуется высококвалифицированный специалист, в совершенстве владеющий микроманипуляционной техникой, что препятствует широкому использованию этого метода в клинической практике эмбриологической лаборатории.
Целесообразность проведения микрохирургического удаления цитоплазматических фрагментов и его влияние на жизнеспособность и потенциал к имплантации эмбриона требуют дальнейшего изучения.
Заключение
У эмбрионов человека, полученных методами ВРТ, фрагментация является достаточно распространенным феноменом в течение раннего эмбрионального развития и становится наиболее распространенной причиной эмбриональных потерь в циклах ЭКО. Она свойственна не только эмбрионам человека, полученным in vitro, но также эмбрионам практически всех видов домашних животных, полученным как in vitro, так и in vivo. Анализ ультраструктуры цитоплазматических фрагментов показал, что они имеют отчетливую и неповрежденную мембрану с некоторыми остатками микроворсинок оолеммы. Наиболее многочисленными органеллами, представленными во фрагментах, являются митохондрии. Цитоплазматические фрагменты являются динамической структурой и могут появляться и исчезать в течение предимплантационного развития эмбриона.
Практически во всех системах морфологической оценки жизнеспособности предимплантационных эмбрионов учитывается наличие и объем цитоплазматических фрагментов. Морфология считается самым важным, а зачастую и единственным критерием оценки предимплантационного развития эмбриона, а фрагментация является краеугольным камнем этой системы оценки.
Наличие фрагментации в эмбрионе ухудшает его морфологическую оценку и ассоциировано с более низкой жизнеспособностью эмбриона. Степень фрагментации в эмбрионе может варьировать от нуля до более чем 50% цитоплазматического объема, и в целом уменьшение объема цитоплазмы эмбриона пропорционально увеличению степени его фрагментации.
Несмотря на то что влияние низкой доли фрагментации (<10%) на результативность программ ВРТ является несущественным, значительная доля фрагментации (>25–30%) снижает жизнеспособность эмбрионов. Результаты исследований по микрохирургическому удалению цитоплазматических фрагментов и его положительному влиянию на жизнеспособность эмбрионов и клинические исходы программ ЭКО являются спорными и требуют дальнейшего подтверждения.
