Хронический эндометрит (ХЭ) в современных условиях трактуется как субклиническое воспалительное заболевание, сопровождающееся нарушением репродуктивной функции. Бесплодие, невынашивание беременности, эктопическая беременность, неудачи при проведении программ вспомогательных репродуктивных технологий и другие нарушения репродукции типичны для данной патологии. Среди женщин с верифицированным ХЭ бесплодие диагностируется в 60% случаев, а неудачные попытки ЭКО – в 40–50% случаев [1, 2].
Чаще всего ХЭ является первичным, развиваясь непосредственно в эндометрии за счет внедрения микроорганизмов, передающихся половым путем, или размножения условно-патогенной микрофлоры после внутриматочных лечебных и диагностических манипуляций. Лишь в 5% случаев эндометрит носит вторичный характер, развиваясь при попадании инфекции из экстрагенитальных очагов гематогенным, лимфогенным или нисходящим путями. Общепризнанно, что в этиологии ХЭ превалирует инфицирование условно-патогенными бактериями и бактериально-вирусными ассоциациями. Произойдет ли пенетрация микробных агентов в слизистую матки и разовьется ли при этом воспалительный процесс – в большой степени зависит от состояния иммунной системы пациентки, которое, в свою очередь, во многом определяется генетической предрасположенностью и наличием факторов риска.
В настоящее время установлено, что одно из ведущих мест в патогенезе хронического воспаления слизистой оболочки матки занимает постинфекционный аутоиммунный синдром. Есть основания считать, что развитие аутоиммунного воспаления в эндометрии формируется в результате образования особых внутриклеточных сигнальных комплексов – инфламмасом. Инфламмасомы (inflammasome от англ. inflammation, воспаление), получившие свое название по аналогии с апоптотическими комплексами – апоптосомами, сегодня расматриваются как структурные единицы аутоиммунного воспаления. Эти цитоплазматические мультибелковые образования, формирующиеся в макрофагах, нейтрофилах и дендритных клетках, приводят к запуску воспалительной реакции при контакте клетки с микроорганизмами и играют важную роль в системе врожденного иммунитета [3]. Инфламмасомы рекрутируют цистеиновую протеазу – каспазу-1 (ключевой молекулярный посредник врожденной иммунной защиты), накапливая на своей поверхности молекулы данного фермента до критической концентрации, при которой возникают их олигомеризация и аутокаталитическое возбуждение. Активная каспаза-1 стимулирует созревание и секрецию провоспалительных интерлейкинов (IL)-1β и IL-18, а также высвобождение белков, участвующих в тканевой репарации и цитопротекторных процессах [4].
У части больных после элиминации инфекционного возбудителя инфламмасомы не разрушаются и поддерживают безмикробное (асептическое) воспаление путем стимуляции продукции каспазы и провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли, IL-1β и IL-18). Вероятно, поэтому зачастую при ХЭ не удается выделить вызвавший данное заболевание инфекционный патоген, в результате чего воспаление признается неспецифическим и соответствующая антибиотикотерапия назначается эмпирически [5].
Доказано, что при ХЭ существенно нарушаются межклеточные взаимодействия, повреждается внеклеточный матрикс, нарушаются процессы клеточной выживаемости, поддержания тканевой архитектоники, экспрессии и функционирования стероидных рецепторов. Все это приводит к выраженным изменениям функциональных параметров эндометрия, дегенеративным и трофическим расстройствам (гипоплазия, формирование «тонкого эндометрия») и в итоге к нарушению рецептивности эндометрия, то есть его способности к имплантации, и бесплодию. Г.Т. Сухих и А.В. Шуршалина определяют ХЭ как клинико-морфологический синдром, при котором в эндометрии возникают множественные морфофункциональные изменения воспалительного характера, приводящие к нарушению циклической биотрансформации и рецептивности слизистой оболочки матки [1].
Известно, что низкая рецептивность эндометрия является причиной подавляющего числа неудач при имплантации эмбриона, в том числе при проведении программ ЭКО, и одной из главных причин женского бесплодия.
Согласно данным современной молекулярной медицины, к числу ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия, предопределяющих фертильность, принадлежат гены и кодируемые ими белки HOXА10 и HOXА11 [6, 7]. Гены обширного семейства HOX (Homeobox) кодируют факторы транскрипции, которые, помимо участия в регуляции имплантации в репродуктивном возрасте, на стадии эмбриогенеза абсолютно необходимы для регуляции нормального роста, развития и дифференцировки органов и тканей репродуктивного тракта – матки (в том числе эндометрия) и фаллопиевых труб [8].
HOXA10 и HOXA11 экспрессируются в клетках эндометрия в различных сегментах матки, причем данный процесс является гормонозависимым и активируется под действием прогестерона и эстрогенов в секреторной фазе менструального цикла, достигая максимума в период «окна имплантации» (рис. 1 см. на вклейке) [9]. HOXA10 регулирует экспрессию маркеров рецептивности эндометрия: белка клеточной адгезии интегрина b3 [10], белка, связывающего инсулиноподобный фактор IGFBP-1 [11] и ряда других [12–14], а HOXA11, в числе прочих, регулирует экспрессию гормона пролактина и интегрина a8 [15, 16].
Показано, что у больных эндометриозом экспрессия генов HOXА10 и НОХА11 в эндометрии снижена по причине их аномального гиперметилирования в регуляторном (промоторном) участке. При этом снижается содержание и других клеточных компонентов и белков – медиаторов рецептивности эндометрия, регулируемых генами HOX, таких как эндометриальные пиноподии, интегрин anb3, белок IGFBP-1 [8].
Известно, что снижение уровня содержания белка в ткани может быть вызвано как генетическими причинами (мутацией или полиморфизмом кодирующего его гена), так и эпигенетическими отклонениями, например метилированием промоторной области гена. Такое метилирование происходит по цитозиновому остатку под действием фермента ДНК-метилтрансферазы в строго определенных участках гена – так называемых динуклеотидных островках CpG, которые содержатся в промоторной области подавляющего большинства генов. Промоторное метилирование приводит к снижению экспрессии гена, вплоть до его полной инактивации («эпигенетического молчания») и является одним из ключевых механизмов эпигенетической регуляции.
Следует отметить, что в последнее время, в целом, гинекологические заболевания, в том числе сопровождающиеся бесплодием, все чаще начинают рассматриваться как эпигенетические заболевания, при которых отмечается аномальный уровень метилирования генов, участвующих в их патогенезе. Так у больных эндометриозом, кроме генов рецептивности HOXА10 и НОХА11, в эндометрии наблюдалось аномальное метилирование генов эстрогеновых рецепторов b, прогестероновых рецепторов В (PR-B), гена белка адгезии кадгерина Е, а также генов ароматазы и стероидогенного фактора 1 (SF-1), контролирующих биосинтез эстрогена [17–24].
Было показано, что гены HOXA гиперметилированы и, как следствие, неактивны у 70–100% бесплодных женщин с эндометриозом и миомой, а также у 56% женщин с необъяснимым бесплодием [5, 8, 25, 26]. В то же время метилирование генов HOXA10 и HOXA11 в образцах ткани, взятых у здоровых доноров, отсутствовало [18, 20]. Эти данные позволили, во-первых, говорить об эпигенетической составляющей патогенеза данных заболеваний, а во-вторых, о ДНК-метилировании как о потенциальном диагностическом маркере состояния бесплодия, возникающего при указанных патологиях [17, 21].
В настоящее время эпигенетическое молчание прогестерон-респонсивных генов, в том числе генов HOXA, вызванное их промоторным гиперметилированием, рассматривается как механизм развития резистентности к прогестерону при эндометриозе, для преодоления которой предлагается использование эпигенетических препаратов – ингибиторов ДНК-метилирования, восстанавливающих активность «молчащих генов» и, как следствие, нормальную рецептивность эндометрия [8].
Данных по изучению метилирования генов HOXA10 и HOXA11 в эндометрии у пациенток, страдающих бесплодием на фоне ХЭ, до сих пор опубликовано не было. В последние годы в литературе появились указания на то, что при ХЭ, в том числе сочетающимся с бесплодием, может отмечаться недостаточность функции прогестероновых рецепторов [27, 28].
Целью данной работы было исследование статуса метилирования промоторных участков генов HOXA10 и HOXA11 в биоптатах эндометрия у женщин, страдающих бесплодием на фоне ХЭ.
Материал и методы исследования
Образцы ткани. Биоптаты эутопического эндометрия были получены у 25 пациенток в возрасте от 28 до 40 лет, страдающих бесплодием на фоне ХЭ, в ходе диагностической контрольной гистероскопии и лечебно-диагностического выскабливания полости матки. В анамнезе у пациенток исключался рак эндометрия, поскольку, согласно данным литературы, при данной онкопатологии в опухоли отмечается аномальное гиперметилирование гена HOXА10 [29]. Полученные образцы ткани были трижды промыты буфером PBS (натрий-фосфатный буфер) и заморожены при температуре -20oС перед отправкой на исследование.
Реагенты. PBS (натрий-фосфатный буфер) (Cell Signalling Technologies, США), этанол (Sigma-Aldrich, США).
Выделение ДНК. Полученные образцы эндометрия измельчали хирургическим скальпелем и гомогенизировали в гомогенизаторе FastPrep-24 (MP Biomedicals, США) с добавлением матрикса D. Из полученных образцов выделяли ДНК с использованием и по протоколу набора ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System (Promega, США). Концентрацию ДНК определяли флуориметрически с использованием стандартного набора Qubit dsDNA HS Assay Kit на флуориметре Qubit 2.0 (Life Technologies, США).
Бисульфитная конверсия. 150 нг полученной ДНК подвергали бисульфитной конверсии (переводу неметилированных остатков цитозина в тимин при сохранении метилированных остатков цитозина в неизмененном виде) с использованием набора MethylEdge Bisulfite Conversion System (Promega, США). Концентрацию конвертированной ДНК определяли фотометрически в планшете µ-drop (BMG Labtech, Германия) с использованием мультидетектора CLARIOstar (BMG Labtech, Германия).
Проведение ПЦР. 20 нг бисульфит-конвертированной ДНК отбирали для последующей ПЦР-амплификации с использованием полимеразной смеси GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega, США) и следующих праймеров:
HOXA10F
5’-TATGATATTGTTGTGGGATAATTTG-3’
HOXA10R
5’-CATAAACACCCCACTTATTAACTAC-3’
HOXA11F
5’-ATTAGTATTTTTTTGTTAAGGATGGG-3’
HOXA11R
5’-CCTACAAACAATCTCTATACAC-3’
Наличие и размер (длину) ПЦР-продуктов определяли посредством электрофореза в 2,5% агарозном геле с маркерами молекулярного веса 100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad, США). Полученные ПЦР-продукты выделяли из геля с использованием набора PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen, США).
Секвенирование. Секвенирование проводилось в центре коллективного пользования «ГЕНОМ» на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по стандартному протоколу с использованием прямых праймеров и набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1. Анализ продуктов реакции проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США).
Статистический анализ. Статистический анализ результатов секвенирования проводили с использованием программного обеспечения DNA Sequencing Analysis Software версии 5.1 (Applied Biosystems, США) и BiQ Analyzer (biq-analyzer.bioinf.mpi-inf.mpg.de). Уровень ДНК-метилирования оценивали качественно (наличие/отсутствие).
Результаты и обсуждение
После процедуры выделения геномной ДНК было получено 25 опытных образцов, которые затем были подвергнуты бисульфитной конверсии. Для последующего проведения ПЦР-анализа и секвенирования были отобраны фрагменты I и II промоторных участков генов HOXA10 и HOXA11 соответственно, поскольку, согласно данным литературы, именно в этих фрагментах отмечается наибольший уровень метилирования по сравнению со здоровыми донорами [18, 20].
Результаты секвенирования представлены на рис. 2 и рис. 3 (см. на вклейке). Из данных рисунков видно, что метилирование в промоторном участке гена HOXA10 наблюдалось у 21 пациентки из 25, то есть в 84% случаях, а гена HOXA11 – у 16 из 25 пациенток, то есть в 64% случаев. Как мы отмечали выше, согласно данным литературы, в эндометрии здоровых женщин репродуктивного возраста промоторное метилирование указанных генов отсутствует [18, 20]. Таким образом, можно сделать вывод, что у больных, страдающих бесплодием на фоне ХЭ, имеет место аномальное промоторное гиперметилирование генов HOXA10 и HOXA11, приводящее к снижению их экспрессии и понижению уровня кодируемых ими белков. Следует, однако, отметить, что во всех исследованных образцах наблюдалось лишь частичное метилирование промоторного фрагмента, что может объясняться присутствием в них ДНК из других клеток и диктует необходимость более тщательного отбора исходных тканевых образцов и/или их подготовки к последующему исследованию.
Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов. Ранее был доказан факт аномального гиперметилирования и, как следствие, инактивации, генов HOXA у подавляющего большинства бесплодных женщин с эндометриозом и миомой матки, а также у женщин с необъяснимым бесплодием [5, 8, 25, 26].
Есть все основания полагать, что аномальное промоторное гиперметилирование генов HOXA10 и HOXA11 в эндометрии является причиной их функционального выключения, которое, в свою очередь, приводит к нарушению процесса имплантации и в итоге к бесплодию.
Более тщательный анализ результатов исследования уровня метилирования гена HOXA10 и сопоставление их с историями болезней пациенток, а именно с продолжительностью периода диагностированного у них на фоне ХЭ бесплодия, позволил нам выявить отчетливую корреляцию между этими двумя параметрами. Так при бесплодии продолжительностью от 6 мес. до 1 года уровень метилирования гена HOXA10 cоставлял в среднем 5,7%, при бесплодии длительностью 2–3 года – 29%, 5–6 лет – 41%, а у пациенток с длительным (10 лет и более) бесплодием и/или привычным невынашиванием беременности отмечался уровень метилирования, приближающийся к 50%.
На основании полученных нами данных можно сделать следующие выводы:
- у женщин репродуктивного возраста, страдающих бесплодием на фоне ХЭ, отмечается аномальное гиперметилирование промоторных участков генов HOXA10 и HOXA11;
- уровень метилирования промоторного участка гена HOXA10 коррелирует с длительностью периода бесплодия (предварительные данные);
- оценка статуса метилирования генов HOXA10 и HOXA11 может рассматриваться как потенциальный диагностический маркер, а также предикторный фактор при мониторинге лечения бесплодия на фоне гинекологических заболеваний, в том числе ХЭ, и при проведении процедуры ЭКО;
- восстановление фертильности у женщин с эпигенетическими модификациями генов HOXA10 и HOXA11 маловероятно при современных стандартах лечения бесплодия, ассоциированного с гинекологическими заболеваниями. Необходима разработка современных схем комбинированной терапии с использованием препаратов, обладающих эпигенетической активностью (ингибиторов ДНК-метилтрансфераз), восстанавливающих активность указанных генов [21, 30].
В многочисленных экспериментальных исследованиях достоверно установлено, что к таким веществам, в частности, относятся флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG) и индольные соединения: индол-3-карбинол (I3C) и его физиологический метаболит – 3,3’-дииндолилметан (DIM).
