Проблема неинвазивной пренатальной диагностики интересует исследователей и клиницистов в связи с необходимостью своевременной постановки диагноза с минимальным риском для состояния матери и плода. О наличии свободной (внеклеточной) эмбриональной ДНК (сэ-ДНК) в плазме крови матери известно с 1997 г. [1], однако детальные исследования в этой области были проведены в течение последних десяти лет. Эмбриональная ДНК в плазме крови матери составляет небольшой процент относительно всей циркулирующей ДНК, по данным различных авторов 1–2% [2, 3].
Предполагается, что сэ-ДНК попадает в кровь матери несколькими путями: из фетальных клеток, переходящих плацентарный барьер и разрушающихся иммунной системой, в результате лизиса клеток плаценты и прямого выброса ДНК плода в кровь матери [4–6]. Сэ-ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода (у 80% беременных женщин она обнаруживается на 28-й день после зачатия). Эти данные свидетельствуют о том, что сэ-ДНК появляется в крови матери раньше времени формирования системы кровообращения плода. В настоящее время многие работы подтверждают, что источником ДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта.
Задача, стоящая перед исследователями, состоит в количественном определении ДНК плода на фоне большого количества ДНК матери. Некоторые локусы, такие как Y-хромосома или ген RHD (Rhesus D), у беременной с резус-отрицательной принадлежностью крови позволяют детектировать количество ДНК в плазме матери методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определение наличия Y-хромосомы и гена RHD описано в мировой литературе и применяется в клинической практике. Однако таким образом можно определить ДНК плода только у 50% беременных женщин. На данный момент сэ-ДНК используется для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода [7–10].
Новые открытия в эпигеномике сделали возможным использовать определение сэ-ДНК в течение беременности вне зависимости от пола плода. Существуют несколько способов определения доли свободной эмбриональной ДНК в крови матери вне зависимости от пола и резус-фактора плода. Все они основаны на обнаружении различий между ДНК, принадлежащей матери, и ДНК плода.
Одним из методов является определение ДНК плода на основании профиля метилирования. Данный метод основан на эпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именно на различиях в метилировании плодовой ДНК и ДНК матери. В качестве мишеней используются гены, гиперметилированные у плода и гипометилированные у матери, что позволяет использовать чувствительные к метилированию рестриктазы. Подобные ферменты специфично разрушают неметилированную ДНК матери и оставляют только гиперметилированную ДНК плода. После этого становится возможной специфичная детекция свободной ДНК плода методом ПЦР в режиме реального времени [11–13].
К другим методикам относятся определение мутаций, унаследованных от отца, методом MALDI-TOF MS, матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, анализ коротких тандемных повторов. Клиническое применение данных методик описано для неинвазивной пренатальной диагностики талассемии, ахондроплазии, миодистрофии, муковисцидоза и врожденной гиперплазии коры надпочечников.
Клиническое использование количественного измерения сэ-ДНК в настоящее время активно развивается. Еще в 1999 г. было обнаружено почти 5-кратное повышение сэ-ДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [14]. Было установлено, что при преэклампсии происходит выброс в материнский кровоток клеток синцитиотрофобласта, микрочастиц, ДНК и РНК-молекул. Анализ данного материала может расширить понимание вклада плацентарных факторов в этиологию преэклампсии. При дальнейшем изучении этой патологии выявлен не только рост уровня сэ-ДНК, но и значительное повышение общего уровня ДНК матери, причем увеличение обоих показателей соответствовало степени тяжести преэклампсии [15]. Кроме того, было показано, что концентрация сэ-ДНК возрастает задолго до появления первых клинических симптомов. Так как ДНК плазмы является маркером клеточной гибели, повышенный уровень фетальной ДНК может быть результатом некроза и апоптоза клеток плаценты. С другой стороны, нарушение функции почек и печени, наблюдаемое при преэклампсии, ослабляет выведение циркулирующей ДНК из материнской крови. Кроме преэклампсии, были описаны и другие акушерские осложнения, при которых имеет место повышение уровня сэ-ДНК: преждевременные роды, тяжелая рвота беременных, плотное прикрепление плаценты или ее врастание, задержка роста плода (ЗРП), внутриматочные гематомы, многоводие, плацентарная недостаточность [16, 17].
Связь повышенного уровня сэ-ДНК с развитием плацентарной недостаточности была продемонстрирована в нескольких исследованиях. Так исследователями во Франции определен уровень сэ-ДНК у женщин с ЗРП в связи с преэклампсией (группа А, 19 женщин), при ЗРП вследствие других причин (группа В, 31 пациентка). Контрольная группа состояла из 28 женщин (группа С). В результате исследования были сделаны выводы, что уровень как общей, так и сэ-ДНК был достоверно выше при плацентарной недостаточности и ЗРП [18].
В Бристольском университете проводили оценку уровня сэ-ДНК в плазме крови матери во время нормальной беременности и сравнивали с осложненной беременностью (плацентарная недостаточность, преэклампсия и/или ЗРП). В исследование вошли 138 женщин, вынашивающих плод мужского пола, из них у 77 женщин беременность протекала нормально, у 49 осложнилась преэклампсией, у 12 были признаки ЗРП. Уровень сэ-ДНК был значительно выше у женщин с преэклампсией и с ЗРП, чем у женщин с нормальной беременностью, а также наблюдалась взаимосвязь высокого уровня сэ-ДНК со степенью тяжести преэклампсии [19] .
Группой ученых из Копенгагена было проведено исследование, в котором проанализирована взаимосвязь повышенного уровня сэ-ДНК у женщин с высоким риском преждевременных родов. Была обнаружена значительная связь между преждевременными родами и повышенным уровнем сэ-ДНК, точность метода составляла 95%.
Другое исследование было посвящено определению взаимосвязи между уровнем сэ-ДНК в крови матери и сроками родоразрешения [20]. Установлена взаимосвязь высокого уровня сэ-ДНК в крови женщин с развитием спонтанных преждевременных родов. Это наблюдение требует дальнейшего исследования для понимания патогенетических механизмов, лежащих в основе данного состояния.
Кроме того, сэ-ДНК и общая ДНК матери были предложены в качестве потенциальных маркеров для неинвазивной пренатальной диагностики во время беременности. Тем не менее, соотношение изменений уровня сэ-ДНК и материнской ДНК при самопроизвольном выкидыше плодом с анеуплоидией еще не до конца изучено. Так в Корее было проведено исследование, где определялся уровень свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК в кровотоке женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией [21]. В исследование вошли 268 женщин в первом триместре беременности, из них 41 женщина с самопроизвольным выкидышем и нормальным кариотипом плода, 26 женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией и 201 женщина контрольной группы. Неметилированный PDE9A ген был использован для измерения уровня свободной эмбриональной ДНК в материнской плазме. Уровень свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК был значительно выше у женщин с самопроизвольным выкидышем, как с нормальным кариотипом плода, так и с анеуплоидиями, по сравнению с контрольной группой (р<0,001 в обеих группах). В результате был сделан вывод, что высокий уровень сэ-ДНК и общей ДНК матери был выявлен у женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией. Эти результаты показывают, что сэ-ДНК может быть полезным маркером для прогнозирования самопроизвольного выкидыша, как в случаях анеуплоидии, так и при нормальном кариотипе плода.
В настоящее время неясно, достаточной ли точностью обладают методы неинвазивной пренатальной диагностики для того чтобы заменить кариотипирование. Однако определение свободных нуклеиновых кислот может быть использовано для скрининга и определения риска у всех беременных независимо от возраста до постановки окончательного диагноза как самостоятельный метод, так и в дополнение к существующим методам.
Общепринятая пренатальная диагностика у женщин без отягощенного семейного анамнеза состоит из двух шагов: оценка степени риска у всех беременных и последующая пренатальная диагностика в группе высокого риска. «Золотым стандартом» диагностики любой анеуплоидии является получение клеток плодового происхождения путем хориоцентеза или амниоцентеза с последующим кариотипированием и реже молекулярными технологиями. Методы неинвазивной пренатальной диагностики до сих пор не могут быть альтернативой или заменить инвазивные процедуры, особенно в случаях мозаицизма, когда число анеуплоидных клеток уступает нормальным. Авторы полагают, что определение сэ-ДНК может заменить или усовершенствовать существующие скрининговые тесты. Наиболее часто встречающейся анеуплоидией является трисомия по 21-й хромосоме (синдром Дауна). Частота синдрома Дауна строго коррелирует с возрастом матери и составляет от 0,07% в возрасте 20 лет и 1% в возрасте 40 лет.
Существующий протокол скрининга на трисомию по 21-й хромосоме включает определение белковых маркеров материнского происхождения, ассоциированных с синдромом Дауна в совокупности с данными ультразвукового исследования. Степень риска вычисляется для каждой беременности с учетом возраста матери, что повышает уровень определения до 85%, с ложноположительными результатами, равными 5%.
Другие анеуплоидии также могут быть диагностированы по сэ-ДНК в материнской плазме – синдром Эдвардса (трисомия 18), синдром Патау (трисомия 13), числовые изменения половых хромосом – синдром Тернера (Х0), синдром Клайнфельтера (ХХY) и др. Главным различимым фактором при диагностике анеуплоидий является снижение или увеличение специфического хромосомного материала. В целях неинвазивной пренатальной диагностики важно не только определить количество хромосомного материала, но и соотнести его с определенной хромосомой. В настоящее время исследователи не пришли к единому мнению относительно наилучшего метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, обсуждение различных методик продолжается.
Хотя некоторые исследователи полагают, что при анеуплоидиях происходит 2–3-кратное повышение уровня как сэ-ДНК, так и общего уровня свободной ДНК (материнской и эмбриональной), это утверждение подтверждается не во всех работах. Последние исследования показали отсутствие достоверных различий в уровнях сэ-ДНК и общего уровня свободной ДНК при трисомиях по 21-й, 13-й и 18-й хромосомам. Уровень свободной ДНК колеблется в широких пределах, во многом зависит от характера течения беременности, в связи с чем более перспективными являются определение и количественная оценка специфических хромосомных маркеров, которые обязательно меняются при анеуплоидиях.
Требуются дальнейшие исследования в данной области для определения возможностей клинического применения описанных методов как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скрининговых методик.
