Численные хромосомные аномалии, или анеуплоидии, являются одной из основных причин потерь беременности, нарушения развития плода, множественных неэффективных попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), привычного невынашивания беременности и врожденных дефектов [1, 2]. Существует несколько причин развития хромосомных нарушений эмбрионов, к которым относятся как процессы, происходящие непосредственно в гаметах, так и нарушения митотического деления самого эмбриона. В первом случае имеет место нарушение мейотического деления во время оогенеза и сперматогенеза; аномальный процесс кроссинговера при мейотическом делении гамет; нарушение процесса оплодотворения, когда ооцит оплодотворяется двумя сперматозоидами, что приводит к возникновению триплоидии. Реже анеуплоидии возникают во время последовательного митотического деления эмбриона. Например, возникновение полной тетраплоидии при нарушении первого клеточного деления, либо формирование мозаицизма на этапе второго митотического деления эмбриона после образования зиготы [3].
Несомненно, эмбриональный набор хромосом напрямую зависит от хромосомного состава как ооцита, так и сперматозоида, их морфологических и качественных характеристик. Однако наиболее важной составляющей возникновения генетических аномалий эмбриона является анеуплоидия именно женских половых клеток, в основе развития которой лежат два ключевых процесса нарушения мейотического деления: преждевременное расхождение хроматид и нарушение расхождения хромосом в анафазе I [4]. Возможно, это связано с тем, что ошибкам мейоза более подвержен оогенез, чем сперматогенез. Мейотическое деление в процессе сперматогенеза начинается с полового созревания и продолжается в течение всей жизни мужчины. В то время как в женском организме имеет место длительный интервал между началом мейоза, еще во время развития женского эмбриона, и окончанием, уже в зрелом организме во время овуляторных циклов [5]. Так, в первое мейотическое деление вступают примордиальные зародышевые клетки, затем происходит остановка мейоза на стадии профазы I. Возобновляется первое мейотическое деление в ооците под действием пика лютеинизирующего гормона при достижении полового созревания. По всей видимости, именно данный длительный временной интервал является наиболее вероятной причиной частых хромосомных нарушений в ооцитах по сравнению со сперматозоидами. Кроме того, частота анеуплоидий увеличивается с возрастом женщины в связи со снижением количества и качества ооцитов [6–9].
В отечественной и зарубежной литературе описано достаточно большое количество различных гипотез, объясняющих данные процессы [10–12]. Согласно одной гипотезе, качество ооцитов определяется на стадии эмбриогенеза, и в последующем ооциты, менее подверженные нерасхождению хромосом, овулируют первыми, в то время как ооциты низкого качества овулируют в более позднем периоде жизни женщины [13]. Согласно другой гипотезе, с возрастом увеличивается частота воздействия таких повреждающих факторов, как окислительный стресс, нарушение микроциркуляции, гипоксические процессы в фолликулярной жидкости [14]. Многие исследования продемонстрировали, что снижение качества ооцитов ассоциировано именно с митохондриальной дисфункцией [15], что более подробно будет рассмотрено во второй части обзорной статьи.
По данным M. Tsutsumi, R. Fujiwar и соавт. (2014), уровень хромосомных аномалий среди диагностированных самопроизвольных выкидышей у женщин моложе 35 лет составляет около 50%, в то время как у женщин старше 35 лет – 75% [16]. Данные K. Lukaszuk и соавт. (2016), G.C. Ma. и соавт. (2016) свидетельствуют о том, что у женщин старшего репродуктивного возраста до 80% доимплантационных эмбрионов анеуплоидны [17, 18]. Учитывая высокую частоту анеуплоидий эмбрионов данной группы пациенток, можно сделать вывод, что ключевую роль для успешного исхода планируемой беременности в группе женщин позднего репродуктивного возраста играет выбор эмбриона для имплантации. Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) позволяет осуществить селекцию эуплоидных эмбрионов, что, в свою очередь, повышает эффективность программ ЭКО в различных группах пациенток, в том числе и в группе пациенток позднего репродуктивного возраста [17–21]. Однако, несмотря на последние достижения в области молекулярно-генетических технологий, на сегодняшний день не существует единого мнения о преимущественном способе скрининга эмбрионов в циклах ЭКО и о селекции наиболее компетентных эмбрионов для переноса.
До недавнего времени в мире широко использовался метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), посредством которого преимплантационному скринингу подвергалось лишь ограниченное число хромосом (5–12) и частота ошибок составляла 5–15%, что зачастую приводило к неблагоприятным исходам беременности [20, 21]. Современной альтернативой FISH является метод микроматричной сравнительной геномной гибридизации (Array Comparative Genomic Hybridization, aCGH), который позволяет протестировать все 23 пары хромосом (1–22, XY) одновременно, провести анализ множества генов и целых геномов. Установлено, что риск ложноположительного и ложноотрицательного результата при использовании аCGH не превышает 1% [17–19]. Помимо этого, в практику был введен метод высокопроизводительного секвенирования (New Generation Sequensing, NGS), показавший высокие результаты, в том числе повышение точности диагностики мозаичных анеуплоидий [18–23].
Z. Yang, J. Liu и соавт. (2015), проведя сравнительный анализ данных методов, пришли к выводу, что NGS и aCGH сопоставимы по чувствительности и специфичности [20]. На первом этапе исследования в общей сложности 164 продукта полногеномной амплификации, полученные от 38 пациенток в возрасте 35,2±3,4 года после биопсии трофэктодермы бластоцист, подверглись анализу обоими методами. По результатам исследования специфичность NGS составила 100% (95% ДИ: 95,32–100%), чувствительность 100% (95% ДИ: 98,16–100%). Таким образом, как положительная, так и отрицательная прогностическая значимость скрининга методом NGS составила 100%. Данные результаты сопоставимы с результатами скрининга методом aCGH. Однако метод aCGH, в отличие от NGS, не позволяет идентифицировать несбалансированные перестройки за границей разрешения (точечные мутаций, делеции и дупликации ниже границы чувствительности), также ограничена возможность идентификации полиплоидии и мозаицизма низкого уровня (25–30%) [20]. На втором этапе исследования 172 пациентки (в возрасте 35,2±3,5 года) были рандомизированы в 2 группы. В первую группу (А) вошли эмбрионы 86 пациенток, исследованные методом NGS, во вторую группу (В) – эмбрионы 86 пациенток, которым провели скрининг методом aCGH. По результатам данного этапа исследования не было существенных различий в частоте наступления клинической беременности между группами А и В (75,9 и 71,8%, соответственно, р>0,05), а также в показателях прогрессирующей беременности (74,7 и 69,2% соответственно, р>0,05). Кроме того, не было никаких существенных различий в частоте прерывания беременности между группами А и В (1,3 и 2,6% соответственно, р>0,05) [20].
Позднее К. Łukaszuk и соавт. (2015) в своем исследовании, целью которого было изучение связи возраста женщин с частотой и типом анеуплоидий на основании результатов ПГС, подтвердили высокую специфичность и чувствительность NGS, в том числе, в отношении обнаружения мозаицизма и несбалансированных перестроек [21]. По результатам первого этапа исследования трофэктодермы 198 бластоцист женщин различных возрастных групп (<31, 31–35, 36–38, 39–40 и >40 лет), значительное увеличение частоты анеуплоидий наблюдалось в возрасте 39 лет и старше. Соответственно, по мнению авторов, 38 лет является пограничным возрастом, при достижении которого резко снижается эффективность лечения бесплодия. На втором этапе исследования в 29% случаев были обнаружены единичные моносомии, в 22% – единичные трисомии, в 25% случаев – другие аномалии, такие как двойные моносомии и трисомии.
Z. Yang, J. Liu и соавт. (2013) показали аналогичные результаты, используя метод aCGH. В 36% случаев были обнаружены единичные моносомии, 21% составили единичные трисомии и в 29% – двойные моносомии и трисомии [24]. Результаты Z. Yang сильно отличались в количестве обнаруженных комплексных анеуплоидий – 14,7 против 23,9% в исследовании К. Lukaszuk и соавт. (2016) [17]. Тем не менее, после исключения комплексных нарушений, считающихся нарушениями митотического происхождения, частота единичных и двойных анеуплоидий в исследовании К. Lukaszuk и соавт. (2016) составила 66,3–67,4%, по сравнению с результатами, полученными в исследовании Z. Yang и соавт. (2013) – 32,5–33,7% соответственно. Различия в обнаружении комплексных хромосомных аномалий могут быть результатом особенностей проведения данных методик [17, 24].
Таким образом, нет сомнений, что в ближайшем будущем метод NGS будет введен в широкое практическое использование в силу его преимуществ.
В настоящее время в мировой литературе широко обсуждается вопрос о роли митохондриального потенциала ооцитов и бластоцист, как дополнительного метода селекции жизнеспособных эмбрионов.
Митохондрии являются цитоплазматическими двухмембранными органеллами, имеющими свою собственную ДНК. Митохондриальная ДНК (мтДНК) представляет собой двухцепочечный циркулярный геном, который составляет приблизительно 16,6kb и находится в митохондриальном матриксе. МтДНК кодирует основные белки цепи переноса электронов, которая генерирует подавляющее большинство клеточного АТФ путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) [15, 25].
По данным ряда зарубежных авторов, существует прямая связь между митохондриальным потенциалом ооцитов/эмбрионов и их качеством [8, 15, 26, 27].
Эмбрионы млекопитающих, в том числе человека, наследуют митохондрии от матери, и исходное количество мтДНК ооцитов определяет энергетический потенциал ранних эмбрионов в течение первых трех дней преимплантационного развития, так как на данной стадии развития отсутствует репликация мтДНК, а энергетический метаболизм происходит по анаэробному пути (гликолиз, пентозофосфатный путь). Полноценная репликация мтДНК начинается на стадии бластоцисты (пятидневного эмбриона), когда необходим адекватный уровень энергии для успешного деления. На данном этапе происходит переход от анаэробного пути метаболизма энергии к аэробному (окислительное фосфорилирование) [8, 28–30].
Особенно тщательно мтДНК исследовалась на животных моделях (ооциты мышей, свиней). Было доказано, что более успешно оплодотворялись те ооциты, которые содержали большее количество мтДНК, чем ооциты со сниженным митохондриальным потенциалом. Стоит отметить, что по данным ранее проведенных исследований, уровень мтДНК в бластоцистах, наоборот, был выше у анеуплоидных эмбрионов, что, видимо, связано с особенностями репликации мтДНК [8, 31, 32]. Однако определение митохондриального потенциала ооцитов человека для прогнозирования результатов оплодотворения имеет как этические, так и технические ограничения. В связи с чем M. Ogino, H. Tsubamoto и соавт. (2016) предположили, что количественное определение мтДНК в кумулюсных клетках и клетках периферической крови может коррелировать с митохондриальным потенциалом ооцитов и являться достоверным прогностическим маркером получения эмбрионов хорошего качества в программах вспомогательных репродуктивных технологий [15]. В ходе исследования были проанализированы 60 образцов кумулюсных клеток тридцати женщин, у восемнадцати из них были взяты образцы крови. Для 30 пациенток со средним возрастом 37 лет и индексом массы тела 21,4±2,0 установлена высокая корреляция между уровнем мтДНК в кумулюсных клетках и клетках периферической крови (коэффициент корреляции Пирсона r= 0,900, р<0,0001). Содержание мтДНК в кумулюсных клетках ооцитов, из которых в последующем образовались эмбрионы хорошего качества, было выше, чем в кумулюсных клетках ооцитов, при оплодотворении которых формировались эмбрионы низкого качества. Данные уровни мтДНК составили 140 и 57 копий на клетку соответственно (р<0,0001). Содержание мтДНК в клетках периферической крови женщин с последующим получением эмбрионов хорошего качества также было выше, чем в клетках периферической крови пациенток с последующим получением эмбрионов низкого качества, и составляло 36 и 13 копий на клетку соответственно (р=0,604). При построении модели логистической регрессии единственно значимым параметром было содержание мтДНК в кумулюсных клетках, а не в клетках периферической крови (р=0,020). По мнению авторов, низкая чувствительность и специфичность метода количественного определения мтДНК в клетках периферической крови для прогноза получения эмбрионов хорошего качества в данном исследовании связана с небольшим размером выборки и, соответственно, необходимостью последующих исследований. Таким образом, по данным M. Ogino, H. Tsubamoto и соавт. (2016), уровень мтДНК в кумулюсных клетках является надежным диагностическим инструментом для прогнозирования качества эмбрионов. Площадь под ROC-кривой (AUC) составляет 0,823, что указывает на высокую прогностическую силу [15].
Ранее, в 2015 году E. Fragouli, K. Spath и соавт. провели исследование, которое выявило четкую связь между количеством мтДНК в клетках трофэктодермы и способностью человеческого эмбриона к имплантации [26]. Цель работы состояла в оценке биологической и клинической значимости определения уровня мтДНК эмбрионов. В частности, исследовалась взаимосвязь между уровнем мтДНК и возрастом женщины, хромосомным набором эмбрионов, потенциалом к имплантации. Кроме того, была проведена количественная оценка мтДНК, детальный анализ полиморфизма митохондриального генома, поиск мутации, делеций. Цитогенетически были протестированы 39 ранних эмбрионов (эмбрионы стадии дробления) и 340 бластоцист. Из них клетки трофэктодермы 302 бластоцист проанализированы методом aCGH, 38 – методом NGS. Из 302 бластоцист 123 были определены как анеуплоидные (99 с помощью aCGH и 24 с помощью NGS), в то время как остальные 217 были охарактеризованы как эуплоидные (203 с помощью aCGH и 14 с помощью NGS). Произвели перенос 131 эуплоидной бластоцисты и 39 нормальных эмбрионов на стадии дробления. В последующем оценивали число копий мтДНК. Было проведено сравнение 148 бластоцист из группы женщин со средним возрастом 34,8 года (26–37 лет) и 154 бластоцисты женщин со средним возрастом 39,8 года (38–42 года) с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Анализ данных ПЦР-РВ показал статистически значимое увеличение количества мтДНК в клетках трофэктодермы бластоцист женщин позднего репродуктивного возраста (р=0,003). Кроме того, образцы трофэктодермы анеуплоидных бластоцист (n=99) содержали значительно больше мтДНК во всех возрастных группах по сравнению с эуплоидными (n=203) (р=0,025). В ходе исследования был определен порог жизнеспособности эуплоидных бластоцист по уровню мтДНК. Ретроспективный анализ биоптатов трофэктодермы перенесенных эмбрионов с известным исходом показал, что 42/42 (100%) бластоцист, которые привели к клинической беременности имели относительный уровень количества мтДНК ниже, чем 0,003 о.е. (пороговый уровень). Кроме того, 14/14 (100%) эмбрионов с относительным количественным уровнем мтДНК выше, чем 0,003, были не способны к имплантации. Также было проанализировано 23 образца трофэктодермы методом NGS для дальнейшей оценки связи между повышенным уровнем мтДНК и неудачами имплантации. Все эмбрионы были эуплоидны и ранее проанализированы с помощью метода ПЦР-РВ. Клинический исход после переноса был известен у 21 из соответствующих бластоцист. Семь из них привели к беременности, тогда как остальные 14 – нет. Из 14 эмбрионов, которые не имплантировались, методом ПЦР-РВ идентифицированы 9, содержащие количество мтДНК выше, чем 0,003 о.е. Анализ NGS подтвердил результаты метода ПЦР-РВ, показав увеличение уровня мтДНК у неимплантированных эмбрионов по сравнению с имплантированными. Повышенное количество мтДНК также наблюдалось еще в 3 образцах трофэктодермы, для которых клинический результат не был известен.
После установления порога жизнеспособности по уровню мтДНК в бластоцисте на основании ретроспективного анализа данных было проведено слепое проспективное исследование для оценки прогностической ценности предложенной модели. Результаты проспективного слепого исследования с использованием того же порогового уровня мтДНК, что и в ретроспективном исследовании, подтвердили, что все бластоцисты, индуцировавшие жизнеспособную беременность, содержали количество мтДНК ниже порогового значения, и ни одна бластоциста с уровнем мтДНК выше этого значения не привела к клинической беременности.
Соответственно, все эуплоидные бластоцисты с надпороговыми уровнями мтДНК в трофэктодерме не имплантировались (100%). Бластоцисты с уровнем мтДНК в нормальном диапазоне имплантировались в 59% случаев, что контрастирует с 38% для группы в целом (то есть где не исследовали уровень мтДНК методом ПЦР-РВ). Полученные данные показывают, что нарушение развития эмбрионов, связанное с повышенным уровнем мтДНК, объясняет до одной трети неудач имплантации эуплоидных бластоцист. По мнению авторов, оценка количества мтДНК в клетках трофэктодермы эмбрионов может стать простым, недорогим и широко применяемым клиническим исследованием, позволяющим повысить эффективность лечения бесплодия [26].
Заключение
Таким образом, нет сомнений, что в ближайшем будущем метод NGS будет введен в широкое практическое использование в силу его преимуществ.
Кроме того, изучение митохондриального потенциала ооцитов и эмбрионов может стать дополнительным достоверным предиктором исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий в различных группах пациентов, в том числе в группе пациенток позднего репродуктивного возраста.
