Согласно современным представлениям, гестоз определяют как генетически детерминированную недостаточность процессов адаптации материнского организма к новым условиям существования, которые возникают с развитием беременности. Состояние иммунной системы матери играет значительную роль для благоприятного исхода беременности, а дисфункция эндотелия рассматривается как ведущее звено в развитии гестоза.
Маннозосвязывающий лектин (mannose-binding lectin – MBL) – белок плазмы крови, синтезирующийся в печени, является составной частью иммунной системы. MBL связывается с фрагментами углеводов микроорганизмов и активирует систему комплемента через лектиновый путь. В дополнение к активации комплемента белок имеет несколько различных функций, включая стимулирование комплемент-независимого опсоно-фагоцитоза, модуляцию воспаления и стимулирование апоптоза [5].
Ген MBL (MBL2) находится на 10-й хромосоме и представлен четырьмя экзонами. Наиболее распространенным среди европеоидной расы является полиморфизм codon 34, расположенный
в первом экзоне, вариантный В-аллель которого обеспечивает пониженный уровень белка MBL в
крови матери [7].
MBL представлен в эндотелии спиральных артерий и в основном локализован в сосудах, содержащих эндоваскулярный трофобласт [1]. Следовательно, он может иметь значение в модулировании иммунных и воспалительных процессов во время беременности.
Целью нашего исследования явилось изучение полиморфизма MBL2 codon 34 у женщин славянской народности, перенесших гестоз во время беременности по сравнению с женщинами, имевшими физиологическое течение беременности.
Материал и методы исследования
Были исследованы 77 родильниц с нормально протекавшей беременностью и 78 родильниц, у которых во время беременности развился гестоз.
Критерии включения для контрольной группы: физиологическое течение беременности, родов и послеродового периода; доношенная беременность сроком 37–42 нед с нормальной массой плода;
одноплодная беременность; отсутствие симптомов гестоза; оба родителя принадлежат к европеоидной расе (славянам); удовлетворительный социально-экономический уровень жизни семьи.
Критерии включения для группы гестоза: наличие у беременных симптомов гестоза различной степени тяжести («чистый» гестоз); одноплодная беременность; оба родителя принадлежат к славянам; удовлетворительный социально-экономический уровень жизни семьи. Критерии исключения для группы контроля: экстрагенитальные заболевания и наличие специфических инфекций; фетоплацентарная недостаточность и задержка роста плода во время настоящей беременности; гестоз в анамнезе (и в анамнезе близких родственниц).
Критерии исключения для женщин с гестозом: сопутствующие экстрагенитальные заболевания, диагностированные вне беременности; наличие специфических инфекций; нейроинфекции, черепно-мозговые травмы в анамнезе; нейродегенеративные заболевания, опухоли головного мозга; наличие у плода аномалий развития; вредные привычки женщины (курение, злоупотребление алкоголем, наркотиками).
Критерии диагноза «гестоз»: артериальная гипертензия (повышение систолического давления >135 мм рт. ст., диастолического >85 мм рт. ст.), при гипотензии – увеличение систолического давления на 30 мм рт. ст. и более от исходного до беременности, а диастолического – на 15 мм рт. ст. и выше; протеинурия – от 300 мг/сут; отеки ног, рук, живота, лица (не пропадают после ночного отдыха), патологическая прибавка массы тела (>350 г за неделю, неравномерно).
Беременные основной и контрольной групп были сопоставимы по возрасту, числу беременностей и родов в анамнезе.
Для генетического исследования выполнялась экстракция геномной ДНК на сорбенте из лимфоцитов периферической цельной крови при помощи коммерческого набора «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Москва).
Характеристика исследованных аллельных вариантов гена MBL2 приведена в табл. 1. Определение аллельных вариантов гена MBL2 codon 34 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) при помощи амплификатора «Mastercycler gradient» («Eppendorf», Германия). Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов выбирали из интернет-баз «Nucleotide» и «Ensembl» (США). Праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы «BLAST» (NCBI, США). Были использованы следующие последовательности праймеров:
5’-AGGACAGAGGGCATGCTC-3’ 5’-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3’.
Таблица 1. Характеристика исследованного гена MBL2 и его аллельных вариантов.
Полученные ампликоны были обработаны эндонуклеазой AccB1I, согласно рекомендациям фирмы-изготовителя («Fermentas», США). Для электрофореза и визуализации результатов продукты амплификации и рестрикции разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном водным раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл). Результаты анализа фиксировали с помощью системы видео-гельдокументации «Versa Doc RG 3000» («Bio-Rad», США). Нормальный (дикий) тип аллеля (аллель А)
был разрезан эндонуклеазой на два фрагмента размерами 260 bp и 89 bp, вариантный (мутантный)
аллель (аллель В) остался неразрезанным. Достоверность значений определялась в программе Statistica с использованием четырехпольных таблиц при подсчете значения p по точному двустороннему тесту Фишера.
Эксперименты соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, разработанной в соответствии с Хельсинкской декларацией «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в РФ», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 №266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в нем.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате исследования было получено, что гомозиготы по аллелю А статистически значимо реже встречаются у женщин с гестозом по сравнению с контрольной группой (59 и 76,6% соответственно, р=0,0252) (табл. 2). Доля гетерозигот значительно выше в основной группе по сравнению с контролем, но без статистической значимости (28,2 и 15,6% соответственно, р=0,08). Количество гомозигот по аллелю В также статистически недостоверно выше у женщин, перенесших гестоз, по сравнению с контрольной группой (12,8 и 7,8% соответственно, р=0,4295). Однако вариантный аллель ассоциирован с развитием гестоза (26,9% при гестозе и 15,6% в контрольной группе, р=0,0181), что также подтверждается при сравнении частоты встречаемости гетеро- и гомозигот по вариантному
аллелю (АВ+ВВ) среди женщин с гестозом и в контрольной группе (41 и 23,4% соответственно,
р=0,00252).
Таблица 2. MBL2 codon 34 полиморфизм у женщин с гестозом по сравнению с контролем.
Полученные данные идут вразрез с данными венгерских исследователей, где гомозиготность по аллелю дикого типа гена маннозосвязывающего лектина (MBL2) в 54-м кодоне наиболее характерна для женщин с гестозом и Hellp-синдромом. Вариантный B аллель превалировал среди здоровых беременных женщин [3]. Так, по данным I. Sziller (2007) сниженная способность к MBL-опосредованной активации комплемента также может ограничивать комплемент-опосредованное уничтожение полуаллогенных фетальных клеток во время беременности и тем самым изменять вероятность развития преэклампсии
и Hellp-синдрома [3]. I. Sziller и соавт. выдвинули предположение, что экспрессия отцовских антигенов на клетках плода может вызывать активацию материнского каскада комплемента по пути MBL, которая вносит свой вклад в разрушение клеток трофобласта фетоплацентарной системы. Компоненты комплемента присутствуют на клетках плода, в плаценте в децидуальных спиральных артериях и при
нормальной беременности, однако у женщин с гестозом в плаценте отмечено значительное увеличение отложения ранних и поздних компонентов комплемента. Таким образом, чрезмерное
MBL-опосредованное повреждение трофобласта ухудшает его инвазию в спиральные артерии при
имплантации. Носительство матерью мутантного аллеля MBL может привести к снижению уровня MBL и, следовательно, к уменьшению способности к комплемент-зависимому лизису клеток трофобласта через путь MBL [3].
По данным N.G. Than и соавт. (2008), средний уровень белка MBL в плазме матери выше у женщин с гестозом по сравнению с женщинами с нормальной беременностью [4]. Однако полиморфизм гена MBL в данном исследовании не исследовался, следовательно, не представляется возможным оценить, насколько данное повышение уровня MBL связано с генетическими особенностями данного белка.
С другой стороны, по данным датских исследователей, женщины с привычным поздним прерыванием беременности (ПППБ) имеют генотип MBL2, ассоциированный с дефицитом данного белка (26,7% у женщин с поздними выкидышами и 12,5% у контрольной группы, р<0,02). А среди 38 пациенток с идиопатическим ПППБ 36,8% являются носителями генотипа MBL2, кодирующего низкую продукцию белка, что значительно выше по сравнению с контролем (р=0,001) [2].
Более того, авторы выявили, что у женщин с дефицитом данного белка в результате полиморфизма MBL2 codon 34 дети имеют более низкую массу при рождении по сравнению с детьми женщин без мутации. Дефицит MBL у женщин с привычным невынашиванием был ассоциирован со значительной задержкой роста плода при доношенной беременности [2].
Это дало основание авторам сделать вывод, что в результате дефицита MBL страдает плацента, MBL модулирует воспаление путем очищения плазмы крови от обломков клеток после апоптоза, регулирует уровень фактора некроза опухоли (ФНО). Известно, что с увеличением гестационного срока в крови матери увеличивается количество обломков клеток трофобласта в результате апоптоза этих клеток. При недостаточности функции MBL не происходит адекватного очищения плазмы крови от этих обломков, а также увеличивается уровень ФНО, который в свою очередь увеличивает апоптоз трофобласта. В результате происходит повреждение эндотелия и развивается системный воспалительный ответ [2].
Эта же гипотеза поддерживается и голландскими исследователями. По данным Van de Geijn и соавт. (2007), нет ассоциативной связи гестоза с генотипами MBL, однако генотипы с низкой продукцией MBL могут рассматриваться как модификаторы гестоза. Таким образом, MBL может участвовать в моделировании воспаления плаценты, обеспечивая удаление остатков клеток после их апоптоза [6].
Схожие данные были получены и бразильскими исследователями, где генотипы, связанные с низкой продукцией белка MBL, ассоциированы с развитием гестоза у беременных женщин [8].
Заключение
Таким образом, с увеличением гестационного срока в крови матери увеличивается количество апоптотических клеток трофобласта. MBL в свою очередь очищает плазму крови от обломков клеток после апоптоза, а также регулирует уровень ФНО.
Во время гестоза в результате ишемии/реперфузии плаценты наблюдается повышенный выброс обломков клеток трофобласта после апоптоза в кровоток матери по сравнению с физиологической беременностью. При недостаточности функции MBL в результате генотипически обусловленного MBL-дефицитного состояния не происходит адекватной утилизации этих обломков, повышается уровень ФНО, который в свою очередь вызывает апоптоз трофобласта, замыкая порочный круг, и развивается системный воспалительный ответ.
Можно сделать вывод, что гестоз – это мультифакторное, полигенетически обусловленное осложнение беременности. Для прогноза данного заболевания следует разрабатывать индивидуальный подход для каждой женщины с учетом ее генотипа, образа жизни, а также определенных факторов окружающей среды. Данное исследование показывает, что среди славянских женщин носительство мутантного аллеля гена MBL2 codon 34 увеличивает шанс развития у них гестоза в 2 раза. Полиморфизм MBL2 codon 34 имеет значительную ассоциацию с развитием гестоза. Однако для более точного и детального заключения о роли полиморфизма MBL2 codon 34 в развитии гестоза следует провести исследование, используя большую выборку исследуемых групп. А также рассмотреть данный полиморфизм в связке с другими генетическими маркерами, способными прогнозировать развитие гестоза, для оценки более полного генетического риска данного заболевания.
