Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) остается одной из самых актуальных тем в акушерстве и гинекологии, что обусловлено как высокой распространенностью этого заболевания, так и большим количеством нерешенных вопросов, связанных с патогенезом, диагностикой и лечением этого симптомокомплекса.
СПКЯ встречается у 5–10% пациенток с бесплодием и более чем в 80% является причиной ановуляторного бесплодия [1]. Это сложное многофакторное заболевание с мультигенным наследованием, формирующееся под влиянием эпигенетических факторов и факторов окружающей среды. Многообразие всех этих факторов приводит к многообразию фенотипов СПКЯ с разным сочетанием основных клинических проявлений: гиперандрогении, олигоановуляции и поликистозной морфология яичников по данным ультразвукового исследования [2].
За последние 5 лет опубликовано более 3172 статей, связанных с СПКЯ [3], большая часть из них посвящена этиологии и патогенезу этого заболевания. В последние годы большое внимание уделяется такому новому направлению, как персонализированная медицина, которая на основании выявления биомаркеров позволяет уточнять конкретный фенотип заболевания, прогнозировать индивидуальные риски и проводить раннюю профилактику, подбирать индивидуализированную терапию и прогнозировать ответ на лечение, избегая при этом побочных эффектов, которые могут возникнуть у конкретной пациентки, более точно подбирать дозы, и наконец, прогнозировать клинический исход заболевания [4]. Для реализации принципов персонализированной медицины используют достижения «омикс»-технологий. Все они основаны на греческом суффиксе «-ом», означающем «имеющий природу». Геном – это последовательность генов в организме, последовательность генома является относительно постоянной характеристикой организма. Транскриптом является продуктом экспрессии генома, это совокупность всех молекул РНК, которые синтезируются в клетке, в каком-то органе или ткани. Так как разные клетки в разные моменты времени экспрессируют разные гены, то и набор белков будет различаться. Это соображение подтолкнуло ученых к исследованию протеома человека — созданию полного перечня белков, которые присутствуют в разных клетках и тканях человека в каждый момент времени. Протеомика (англ. proteomics) – наука, изучающая белковый состав биологических объектов, а также структурно-функциональные свойства белковых молекул. Ее задачей является идентификация и количественное определение совокупных индивидуальных белков, которые содержатся в биологических образцах (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, биоптаты) на разных стадиях развития заболевания, а также на фоне проводимой терапии [5].
Преимуществом протеомики перед геномикой является тот факт, что наличие какого-либо гена в геноме еще не означает, что с него производится транскрипция, а наличие транскрипта не означает, что с него происходит трансляция. Даже если это и происходит, то транскрипт не позволяет однозначно говорить о структуре белка, его созревании и локализации. Для ответа на эти вопросы и необходим арсенал современной протеомики. Анализ протеома дает больше информации, чем сравнение уровня экспрессии по мРНК, так как учитывает еще и посттрансляционные модификации и альтернативный сплайсинг. Также преимуществом протеомики является возможность выявить межбелковые взаимодействия. Несмотря на то, что эти взаимодействия бывает сложно интерпретировать, эти данные имеют самую высокую ценность для разработки новых методов диагностики и лечения [6].
Достижения протеомики оказались востребованными и в области изучения бесплодия. Ведется поиск «белков фертильности», особенно много работ посвящено протеомике эндометриоза, бесплодия неясного генеза и СПКЯ [7].
Методология протеомного анализа при СПКЯ
Для протеомного анализа при СПКЯ используют различные биологические жидкости (плазма и сыворотка крови, фолликулярная жидкость), ткани (мышечная, висцеральная, яичниковая) и клетки (лимфоциты, клетки гранулезы). Кровь легко получить, она отражает состояние всего организма на момент забора анализа, однако динамическая вариабельность и чрезвычайная сложность протеома крови человека делает протеомный анализ крови/сыворотки очень непростым. Более того, большое количество альбумина и других циркулирующих белков, таких как иммуноглобулины, усложняет сепарацию белков. Удаление этих лишних белков облегчает выделение других с помощью двумерного гель-электрофореза, однако удаление альбумина может повлечь удаление и других белков, которые могут неспецифически связываться с альбумином [8].
Оценка протеома тканей с большей вероятностью отражает патогенез заболевания, но получение образцов требует инвазивных методов, количество образцов обычно небольшое.
Следующим этапом является очистка образцов, а затем сепарация и идентификация белков. Наиболее часто для разделения белков используют метод двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (2-DE), а для идентификации белков применяют масс-спектрометрию (MS) [9]. Также для сепарации и идентификации белков используют такие методики, как активируемая поверхностью лазерная десорбция/ионизация с масс-спектрометрий (SELDI MS) или матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS), когда разделение белков происходит не в геле, а в электрическом или магнитном поле. В последние годы для поиска потенциальных биомаркеров используется комбинация технологий высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS/MS) [10]. Каждая платформа имеет свои преимущества и недостатки, и единого метода, который бы позволял изучить весь протеом, не существует, разные технологии дополняют друг друга [11]. Размер выборок в исследованиях по протеомике составляет в среднем от 3 до 30. В настоящее время нет официальных ограничений по размеру выборки в протеомных исследованиях, тем не менее, следует использовать выборки большего размера, чтобы отличить различия, связанные с заболеванием, от исходных различияй пациентов. Из-за небольших размеров выборок в протеомных исследованиях используют дополнительные технологии, такие как вестерн-блот или протеиновый иммуноблот, когда белки определяют с помощью антител, специфичных к заданному белку. Этот метод используют для подтверждения наличия (валидации) выделенных белков [12].
Также очень важно понять характер взаимодействия между выделенными белками в организме человека. Конечным этапом столь трудоемкого и многоступенчатого исследования является идентификация белка при помощи баз данных (биоинформатика) [5]. В 2015 году была создана база данных PCOSKB [13], в которой представлена информация о 241 гене, связанном с СПКЯ, 114 нуклеотидных полиморфизмах, 175 биохимических путях и 500 заболеваний, связанных с СПКЯ.
Несмотря на активное развитие биотехнологий, сохраняются определенные ограничения, с которыми связана протеомика СПКЯ. К ним относятся:
- Гетерогенность используемых диагностических критериев СПКЯ.
- Отсутствие руководств по клиническим протеомным исследованиям.
- Разные виды образцов и малые размеры выборки.
- Использование различных протеомных платформ.
- Необходимость разработки новых компьютерных технологий для оценки биологической значимости выявленных белков.
- Валидация полученных данных.
- Внедрение экспериментальных данных в клиническую практику.
Исследования по протеомике при СПКЯ
Известно, что СПКЯ является следствием наследственной предрасположенности, однако многочисленные генетические исследования по сравнению здоровых женщин и пациенток с СПКЯ не смогли получить четкое представление о причине возникновения этого заболевания [14]. Акцент сместился в сторону протеомики. Наиболее крупные исследования по протеомике СПКЯ представлены в табл. 1.
M. Insenser и соавт. [15] провели анализ плазменного протеома, который показал, что при СПКЯ снижается выработка β-цепи гаптоглобина и α2-макроглобулина и повышается уровень трансферрина и свободной легкой каппа-цепи. Изменение экспрессии гаптоглобина и трансферрина при СПКЯ были выявлены и другими авторами, в том числе в фолликулярной жидкости. Эти изменения свидетельствуют о роли хронического воспалительного процесса и нарушения обмена железа при СПКЯ. H.F. Escobar-Morreale в 2012 г. [16] также показал, что при СПКЯ повышается выработка гепсидина, который увеличивает абсорбцию железа в кишечнике и снижает высвобождение железа из макрофагов. Все это приводит к избыточному накоплению железа в организме. Гемохроматоз или переизбыток железа усугубляет инсулинорезистентность, нарушает толерантность к глюкозе и способствует формированию сахарного диабета 2-го типа при СПКЯ.
В 2014 г. G.Á. Martos-Moreno и соавт. провели анализ плазменного протеома у детей с ожирением и показали снижение содержания нескольких изоформ аполипопротеина-A1, апо-J/кластерина, витамин D-связывающего белка и транстиретина и повышение уровня низкомолекулярных изоформ гаптоглобина [17].
Чрезвычайно перспективным направлением является изучение протеома жировой ткани, важного эндокринного органа, участвующего во многих физиологических и патологических процессах, включая апоптоз, воспаление, атерогенез, контроль АД, ангиогенез, коагуляцию, фибринолиз, иммунные реакции [18].
Соответственно, жировая ткань стала объектом исследований молекулярных биологов, однако количество таких работ немногочисленно из-за сложностей получения биологического материала [19]. Протеомный анализ сальниковой жировой ткани при СПКЯ был выполнен в 2008 г. M. Corton и соавт. [20].
Сальниковая жировая ткань была получена при бариатрической операции. У больных с ожирением и СПКЯ в отличие от пациенток с ожирением без СПКЯ было выявлено повышенное (более чем в 2 раза) содержание белков, связанных с метаболизмом липидов и глюкозы, окислительным стрессом и дифференцировкой адипоцитов. Эти изменения поддерживают теорию о важной роли висцерального ожирения в патогенезе СПКЯ.
В 2016 г. группа авторов под руководством M. Insenser провела сравнение протеома скелетной мышечной ткани у женщин с гиперандрогенией и ожирением, у женщин с ожирением и без гиперандрогении и у мужчин с ожирением. У женщин с гиперандрогенией и ожирением уровни гликогенфосфорилазы, пируваткиназы, b-энолазы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, креатинкиназы и десмина были ниже, чем у женщин с ожирением и без гиперандрогении и у мужчин с ожирением [21].
Протеомный анализ яичниковой ткани при СПКЯ также чрезвычайно важен, так как может отражать тканеспецифические изменения при этом заболевании. Клетки гранулезы играют важную роль в правильном развитии ооцита. Пациентки с СПКЯ имеют избыточное количество фолликулов, и их клетки гранулезы могут обладать патологической реакцией на ЛГ и ФСГ и измененной дифференцировкой и стероидогенезом [22]. Протеомный анализ яичниковой ткани больных с СПКЯ, выполненный X. Ma и соавт., показал изменение экспрессии 69 белков [23].
В исследованиях также изучали протеом периферических T-клеток при СПКЯ для оценки иммунного ответа при этом сложном заболевании [24, 25].
Фолликулярная жидкость играет чрезвычайно важную роль в физиологии роста фолликулов, созревании ооцитов и процессе овуляции. Следовательно, изучение протеома фолликулярной жидкости доминантного фолликула при СПКЯ также очень перспективно, и изменения протеинового профиля в фолликулярной жидкости, окружающей ооцит, может отражать молекулярные дефекты фолликулогенеза [26]. В 2015 г. проведено крупное исследование по сравнению фолликулярной жидкости пациенток с СПКЯ и здоровых женщин. Всего было проанализировано 770 белков, и было показано, что при СПКЯ меняется экспрессия 186 белков, ответственных за фолликулогенез (амфирегулин, гепарина сульфат протеогликан 2, фактор некроза опухоли, интерферон-α-индуцируемый белок 6, плазминоген, LYVE-1 (рецептор гиалуронана 1 эндотелия лимфатических сосудов) и др.). Также было показано, что в фолликулярной жидкости появляются новые белки, функция которых до конца не ясна (супрабазин, S100 кальций-связывающий протеин A7, геликаза с цинк-фингер 2, транскрипционный коактиватор) [27].
Dai и Lu изучали изменения экспрессии белков во время контролируемой индукции суперовуляции [28]. Авторы выявили различия в экспрессии 32 белков в фолликулярной жидкости у пациенток с СПКЯ, из них 20 белков связаны с метаболизмом глюкозы и липопротеинов, клеточной пролиферацией, апоптозом и инсулинорезистентностью. При СПКЯ экспрессия 13 белков была повышена (в большей степени α1-антитрипсина, аполипротеина A-I трансферрина), а 7 белков – снижена. Было сделано предположение, что трансферрин ингибирует связывание ФСГ с рецепторами клеток гранулезы и ухудшает ответ на стимуляцию. Аполипопротеин является компонентом липопротеинов высокой плотности, его высокая концентрация свидетельствует о нарушении липидного обмена и процессов овуляции.
Отдельно изучаются протеомные изменения при синдроме гиперстимуляции яичников (СГЯ) [29]. С использованием трех различных методик были выявлены три наиболее значимых белка: церулоплазмин, комплемент C3, кининоген-1. Кининоген-1 является ключевым узлом взаимодействия с другими важными белками, включая легкую цепь ферритина, церрулоплазмин, гепатоцитарный фактор роста, комплемент C3, гельcолин, связывая, таким образом, различные биологические процессы, включая воспаление, ангиогенез, транспорт и запас железа, свертываемость крови, иммунные реакции, клеточную адгезию и полимеризацию актиновых филаментов. Определение ключевых белков в фолликулярной жидкости позволит использовать их в качестве биомаркеров для оценки эффективности и безопасности программы ЭКО, прогнозировании риска СГЯ, выбора правильной тактики и назначения направленной терапии.
Протеиновые биомаркеры риска других заболеваний при СПКЯ
Активно изучаются молекулярные механизмы взаимосвязи между СПКЯ и другими часто сопутствующими заболевания и осложнениями. Так, N. Galazis и соавт. в 2013 г. [30] изучали взаимосвязь между СПКЯ и раком эндометрия. Было выявлено 9 протеиновых биомаркеров, экспрессия которых была одинаково повышена или понижена как при СПКЯ, так и при раке эндометрия. К ним относятся трансгелин, пируват-киназа M1/M2, гельсолин-подобный кэппирующий белок, глутатион-S-трансфераза P, лейцин-аминопептидаза, пептидил-пролил-цис/транс-изомераза, циклофилин A, компонент комплемента C4A и магний-зависимая супероксиддисмутаза. После подтверждения их клинической значимости эти биомаркеры могли бы помочь в выявлении пациенток, требующих скрининга и повышенных мер по профилактике рака эндометрия при СПКЯ.
В 2015 г. был проведен систематический обзор биомаркеров взаимосвязи между преэклампсией и СПКЯ [31]. Всего были проанализированы данные 1423 пациенток, изучено 192 белка. Было выделено 5 биомаркеров преэклампсии при СПКЯ: трансферрин, фибриноген α и β, кининоген-1, аннексин 2 и пероксиредокин 2. При преэклампсии биомаркеры были выделены в сыворотке и плазме крови, а также в плаценте, а при СПКЯ – в сыворотке крови, фолликулярной жидкости, биоптатах яичника и сальниковой ткани.
Ранее в 2013 г. группой этих же авторов [32] был проведен систематический обзор биомаркеров риска преждевременных родов при СПКЯ. Была выделена панель из 6 биомаркеров, экспрессия которых одинаково менялась при СПКЯ и при преждевременных родах. Эти биомаркеры включали пируват-киназу M1/M2, виментин, фруктозобисфосфат-альдолазау A, белок теплового шока β1, пероксиредоксин-1 и трансферрин. При подтверждении диагностической ценности этих биомаркеров также можно будет использовать их для выявления пациенток с повышенным риском преждевременных родов при СПКЯ.
Также были выявлены биомаркеры повышенного риска сахарного диабета 2-го типа при СПКЯ. К ним относятся пируваткиназа M1/M2 (повышен), аполипопротеин A-I (снижен), альбумин (cнижен), пероксиредоксин 2 (снижен), аннексин A2 (повышен), α1-B-гликопротеин (повышен), флотиллин-1 (повышен), гаптоглобин (повышен) [33].
Анализ результатов исследований по протеомике СПКЯ
В своей публикации в 2009 г. Z.A. Mohamed-Hussein систематизировали данные о возможных генетических и молекулярных сетях взаимодействий генов-кандидатов для развития СПКЯ. Был классифицирован и описан 1081 ген, кодирующий 1066 известных и 15 гипотетических белков, задействованных в развитие симптомокомплекса СПКЯ [34]. Были описаны узлы взаимодействия транслируемых белков, например, один такой узел взаимодействия связан с другими 12 узлами, и в него вовлечен 331 ген. Описанные авторами находки свидетельствуют о том, что к развитию того или иного комплекса симптомов CПКЯ ведет нарушение экспрессии целого множества генов, а прогрессирование заболевания, в свою очередь, обусловливает дальнейшее изменение использования клетками генетической информации [35].
W. Atiomo и соавт. в 2009 г. выполнили анализ всех известных на тот момент биомаркеров СПКЯ по данным различных публикаций [36]. Было проанализировано 17 статей, размер выборок варьировал от 3 до 30, в общей сложности выявлено 148 биомаркеров, из них валидизировано всего 11 биомаркеров. Индивидуальная чувствительность в постановке диагноза СПКЯ с помощью этих белков от 57 до 100%. В трех отдельных исследованиях были выявлены белки, участвующие в антиоксидантных процессах. К ним относятся пероксиредоксин-1, пероксиредоксин-2, глутатион-S-трансфераза, белок теплового шока HSP27. Пероксиредоксин-1 – это антиоксидантный фермент, участвующий в регуляции окислительно-восстановительного потенциала клетки. При СПКЯ снижается его уровень в T-лимфоцитах [25].
Пероксиредоксин-2 тоже является антиоксидантом, при СПКЯ наблюдалось снижение его уровня в сальниковой ткани, что может служить объяснением повышения уровня перекиси водорода (H2O2) в клетках жировой ткани при СПКЯ, что может приводить к повреждению ДНК. Было сделано предположение, что перекисное повреждение ДНК может являться причиной повышения риска рака эндометрия при СПКЯ [20]. Глутатион-S-трансфераза, уровень которой был повышен в сальниковой ткани, участвует в деградации цитокиновых продуктов в клетках и может участвовать в биосинтезе лейкотриенов, простагландинов, тестостерона и прогестерона [20]. Она также выполняет цитопротективную функцию за счет детоксикации продуктов перекисного окисления липидов в адипоцитах. HSP27, уровень, которого снижается в яичниковой ткани при СПКЯ, подавляет генерацию активных форм кислорода. Также описаны другие биомаркеры, связанные с нарушением иммунного ответа и воспалением (комплемент С3, гаптоглобин, белок ингибитор Raf-киназы (RKIP), ингибитор Rho-киназы, F-актин-кэппирующий белок α1, кофилин-1 и аннексин V), которые, как известно, связаны с инсулинорезистентностью, ожирением, риском сердечно-сосудистых заболеваний. Также есть сообщения о связи нарушений в системе комплемента с бесплодием, аутоиммунными заболеваниями [37], ишемической болезнью сердца, инсулинорезистентностью и сахарным диабетом 1-го типа [12].
Таким образом, биомаркеры воспаления могут помочь в выявлении групп риска по метаболическим осложнениям, раку эндометрия при СПКЯ и в прогнозировании ответа на проводимую терапию.
M. Insenser и H.F. Escobar-Morreale в 2013 г. провели обзор и анализ всех исследований по протеомике СПКЯ [38]. Они проанализировали разный биологический материал и разные биологические процессы, в которых участвуют белки, выработка которых оказалась измененной при СПКЯ. Было выделено 10 белков, роль которых подтверждена как минимум в 2 исследованиях. К ним относятся гаптоглобин, трансферрин, альбумин, аполипопротеин AI, аннексин V, белок теплового шока β1, γ-цепь фибриногена, α-1β-гликопротеин, аполипопротеин AI и аполипопротеин AIV. Роль некоторых белковых изменений рассматривается более подробно. Так, снижение концентрации аполипопротеин AI в клетках гранулезы может влиять на экспрессию ферментов стероидогенеза и синтез прогестерона [39]. Гаптоглобин – острофазовый маркер воспаления, выработка которого повышается при инфекционно-воспалительных процессах. Он обладает противовоспалительными свойствами и защищает от оксидативного стресса, связывая высокотоксичные ионы железа, образующиеся в результате внутрисосудистого гемолиза. Авторы обзора предположили, что при СПКЯ возникают мутации в генах гаптоглобина и его посттрансляционные модификации, что приводит к снижению противовоспалительных свойств этого белка [38]. Трансферрин – основной переносчик железа, и его повышение усугубляет переизбыток железа при СПКЯ [16]. Выявление γ-цепи фибриногена и аннексина V поддерживает гипотезу о нарушении гемостаза при СПКЯ [40]. Белок теплового шока β1 (HSPB1) участвует в стероидогенезе и защищает от апоптоза. Его снижение в клетках гранулезы при СПКЯ может усиливать процесс апоптоза внутри фолликула [39]. Было показано, что этот белок уменьшает захват холестерина макрофагами и оказывает атеропротективное воздействие [41]. Повышение уровня HSPB1 у пациенток с СПКЯ и ожирением [42] может являться компенсаторной реакцией на хронический воспалительный процесс, характерный для этого заболевания [43].
В 2014 г. S. Gupta и соавт. в обзорной работе, посвященной роли оксидативного стресса в патогенезе бесплодия, также анализируют данные по протеомике СПКЯ [12]. Авторы обсуждают роль белков теплового шока, повышенного содержания свободного железа, аполипопротеина А1, снижения пероксиредоксина, повышения уровня глутатион-S-трансферазы, аннексина V и пролидазы в патогенезе СПКЯ. Свободное железо способствует образованию гидрококсильных радикалов и вызывает оксидативный стресс, трансферрин подавляет связывание ФСГ с клетками гранулезы, что нарушает нормальный фолликулогенез и ухудшает ответ на стимуляцию, аполипопротеины А1 и А4 играют роль в липидном обмене и ановуляции, пероксиредоксин и глутатион-S-трансферазы участвуют в оксислительно-восстановительных процессах, аннексин V связывается с рецепторами интерферона, а пролидаза, будучи белком из семейства металлопротеиназ, участвует в ремоделировании коллагена (и возможно, овариальной ткани) и в клеточном росте, являясь маркером оксидативного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях и СПКЯ [44–47].
Таким образом, на основании результатов исследований протеомики СПКЯ можно сделать вывод, что в патогенезе СПКЯ важную роль играют нарушения регуляции фибринолиза и тромбообразования, метаболизма глюкозы и липопротеинов, транспорта белков и холестерина, обмена железа, регуляции иммунного ответа, оксидативный стресс, инсулинорезистентность воспаление, апоптоз и ангиогенез.
В табл. 2 представлены основные белки, экспрессия которых нарушается при СПКЯ, с указанием локализации и функциональной роли по данным различных исследований.
Заключение
Активное развитие протеомики позволяет наде-яться на активное внедрение принципов персонализированной медицины, когда на основании определенных биомаркеров можно выделить пациенток с повышенным риском осложнений, обозначить основные дефекты в патогенетических путях развития СПКЯ и подобрать персонализированное лечение. К сожалению, несмотря на то что получено большое количество данных, связанных с СПКЯ, возможность их использования в клинической практике еще требует доказательств. Совершенствование этой технологии позволяет надеяться на получение в ближайшем будущем новых полезных данных, которые могут служить в качестве диагностических или прогностических маркеров или даже могут привести к изменению лечебной тактики.
