Бесплодие является важной медицинской и социальной проблемой. При обследовании бесплодных супружеских пар в 4-40% случаев (по данным разных клиник) нарушений репродуктивной функции ни у мужчин, ни у женщин не обнаруживают и ставят диагноз «бесплодие неясного генеза» [1]. Несмотря на многочисленные исследования, не удается выявить такие особенности спермы пациентов с бесплодием, которые обладали бы существенной клинической значимостью, необходимой для постановки диагноза «мужской фактор бесплодия». Основные параметры спермограммы (концентрация, подвижность, содержание лейкоцитов) и микробиологический анализ эякулята могут быть использованы для отнесения пациентов к фертильной или субфертильной группе, но не для диагностики бесплодия [5, 7]. Установлено, что максимальную диагностическую значимость для выявления мужского фактора бесплодия имеет содержание в эякуляте морфологически нормальных сперматозоидов, оцениваемых с помощью критерия Крюгера. Однако этот тест включает в себя множество морфометрических характеристик для каждого сперматозоида, требует длительного и тщательного анализа каждого образца спермы высококвалифицированным специалистом, и в России этот трудоемкий и субъективный анализ практически не используется. Современным подходом к выявлению дисфункций сперматозоидов является оценка качества ДНК и хроматина с помощью методов TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferases dUTP Nick End-Labeling) и SCSA (sperm chromatin structure assay) [8]. Однако данные об эффективности использования предлагаемых методик в клинической практике остаются спорными [3, 12].
Диагностика мужского бесплодия с вероятностью, близкой к 100%, возможна лишь в случае азооспермии, глобулозооспермии или при полной неподвижности сперматозоидов, обусловленной генетическими факторами, однако такие клинические синдромы в совокупности встречаются менее чем у 10% пациентов с бесплодием [2].
В настоящее время большое внимание уделяется разработке тестов для оценки функций сперматозоидов, определяющих их оплодотворяющую способность. Молекулярные аспекты акросомной реакции (АР) в настоящее время активно исследуются, однако до сих пор не идентифицированы поверхностные рецепторы сперматозоидов, обеспечивающие связывание гамет с физиологическими лигандами, остаются невыясненными механизмы рецепторного экзоцитоза in vivo. Большой интерес представляет недавно выявленная активность ангиотензинпревращающего фермента, локализованного на поверхности сперматозоидов [6, 9, 11], по-видимому, непосредственно влияющая на процесс оплодотворения.
Предполагается, что функциональные тесты могут иметь большее прогностическое значение, чем традиционный анализ спермы [7]. Одной из возможных причин снижения фертильности может быть сниженная оплодотворяющая способность сперматозоидов, обусловленная нарушениями АР.
Акросомная реакция — рецепторопосредованный экзоцитоз акросомного содержимого, обеспечивающий проникновение сперматозоида через оболочки яйцеклетки [13]. Акросома представляет собой мембранно-связанную структуру в передней, заостренной части головки сперматозоида, которая формируется из аппарата Гольджи на ранних стадиях сперматогенеза, в фазе круглых сперматид. Внутреннее содержимое акросомы — акросомный матрикс — содержит несколько ферментов, которые высвобождаются одновременно или последовательно в процессе АР и разрушают прозрачную оболочку яйцеклетки (zona pellucida).
В 1991 г. был предложен эффективный тест для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов — ARIC (AR to ionophore challenge), в котором в качестве индуктора АР использовался ионофор А23187 [4]. Результаты экспериментов in vitro показали высокую прогностическую значимость определения процента сперматозоидов с завершенной спонтанной АР и процента сперматозоидов с завершенной АР после ее индукции ионофором А23187 при диагностике мужского бесплодия [4].
Были выявлены два основных типа нарушений, препятствующих оплодотворению и приводящих к бесплодию, — спонтанная АР, которая происходит еще до взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки, и отсутствие индукции АР при связывании сперматозоида с zona pellucida [13].
В 1996 г. рабочее совещание по современным диагностическим подходам Европейского общества репродукции и эмбриологии человека (ESHRE, European Society of Human Reproduction and Embryology) рекомендовало использование обязательного функционального теста, позволяющего выявлять патологию АР, при анализе спермы бесплодных мужчин [13]. В настоящее время предложенный тест широко используется в клинической андрологической практике и рекомендован ВОЗ для включения в протокол исследования функциональной компетенции сперматозоидов [14]. Рекомендованный тест основан на оценке изменений акросомного матрикса и внутренней акросомной мембраны с помощью флюоресцентной микроскопии. Однако предложенный метод чрезвычайно трудоемок и субъективен.
Нами был разработан объективный способ оценки АР с помощью окрашивания сперматозоидов двумя флюоресцентномеченными лектинами, взаимодействующими с компонентами акросомы, и анализа окрашенных сперматозоидов методом проточной цитофлюорометрии (ПЦМ) [10].
Целью настоящего исследования явилась оценка клинической значимости предложенного нами метода.
Материал и методы исследования
На основании комплексного клинико-лабораторного обследования были сформированы 2 группы. Контрольную группу (1-я) составили мужчины (n=32) из супружеских пар, обратившихся для подбора метода контрацепции, имеющие детей. Женщины, включенные в контрольную группу, в течение последних 12 мес с момента обращения имели беременность.
Во 2-ю группу включили мужчин (n=47) из пар с бесплодием неясного генеза, с нормозооспермией и отсутствием в анамнезе инфекций, передаваемых половым путем, антиспермальных антител, хирургических вмешательств, травм половых органов, орхитов и варикоцеле. Бесплодие неясного генеза у женщин в этой группе было подтверждено с помощью клинико-лабораторного обследования, включавшего тесты функциональной диагностики, проведение лапароскопии, гистероскопии, исследование уровня гормонов, посткоитальный тест, ультразвуковое исследование.
Эякулят получали с помощью мастурбации при половом воздержании не менее 3 и не более 7 дней. Сбор спермы осуществляли в стерильную одноразовую бакпечатку. Анализ спермы (спермограмма) выполнялся согласно стандартизированному протоколу ВОЗ [14]. Суспензию подвижных сперматозоидов получали методом флотации. Для этого на поверхность эякулята с помощью пипеточного дозатора наслаивали 5—8 мл среды 199 и помещали в термостат (37°С) на 30 мин. Аккуратно сверху с помощью пипеточного дозатора отбирали 1—2 мл среды 199, помещали суспензию в пробирки и центрифугировали при 1500 g 1 мин. К осадку добавляли среду 199, содержащую 0,5% бычьего сывороточного альбумина, так, чтобы конечная концентрация клеток составляла 5∙106/мл в объеме не менее 400 мкл, используя для подсчета концентрации сперматозоидов гематоцитометрическую камеру. В каждую из двух про-бирок помещали по 200 мкл суспензии клеток и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем в одну пробирку добавляли 2 мкл рабочего раствора ионофора А23187 (конечная концентрация ионофора 10 мкМ), в другую пробирку добавляли 2 мкл рабочего раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (конечная концентрация ДМСО 0,1%) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После инкубации сперматозоиды 2 раза отмывали фосфатным буфером Дульбекко (ФБД) рН=7,4 и фиксировали, добавляя по 200 мкл холодного (-20°С) метанола в каждую пробирку. Образцы помещали в морозильную камеру и хранили при -20°С не менее 1 ч. хранение образцов при -20°С в течение 1 мес не влияло на результаты анализа.
Фиксированные образцы отмывали 2 раза дистиллированной водой, клетки ресуспендировали в ФБД с добавлением фетальной телячьей сыворотки (конечная концентрация 20%) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
К каждой пробе добавляли 2 мкл рабочего раствора ФИТЦ-P. sativum и 2 мкл рабочего раствора ТРИТЦ-A.hypogaea (конечная концентрация лектинов 0,025 и 2,5 мг/мл соответственно) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Клетки дважды отмывали дистиллированной водой и анализировали с помощью проточного цитофлюориметра FACScan (Becton Dickinson, США). Окно дискриминации (выбор из всех регистрируемых событий тех, которые интересуют исследователя) было установлено в режиме dot plot, где по оси х отложены значения интенсивности прямого светорассеяния, а по оси у— интенсивности углового светорассеяния (рис. 1, а). С помощью окна дискриминации из анализа исключали разрушенные клетки и агглютинаты клеток или латексных частиц. Анализируя в каждой пробе по 5000 клеток, определяли процент сперматозоидов с завершенной АР (рис. 1, в), представленных субпопуляцией клеток со сниженной зеленой и красной флюоресценцией.
Процент спонтанной АР определяли в контрольной пробе, не содержащей ионофор. Процент индуцированной АР определяли в пробе, содержащей ионофор А23187. Индуцируемость АР вычисляли как разность между процентом индуцированной и спонтанной АР.
Результаты исследования и обсуждение
На рис. 1 представлены типичные результаты выявления спонтанной и индуцированной ионофором А23187 АР сперматозоидов фертильного донора. В контрольном образце (см. рис. 1, б), полученном после инкубации клеток без ионофора, интенсивность флюоресценции сперматозоидов максимальна, все сперматозоиды представлены клетками с интактной акросомой. Таким образом, процент спонтанной АР у этого пациента равен нулю. После инкубации с ионофором (см. рис. 1, в) отчетливо выявляются две субпопуляции сперматозоидов: клетки с высоким уровнем зеленой и красной флюоресценции (сперматозоиды с интактной акросомой, субпопуляция 1) и клетки со сниженной интенсивностью как зеленой, так и красной флюоресценции (сперматозоиды с завершенной АР, субпопуляция 2).
На рис. 1, а — окно дискриминации (выбор из всех регистрируемых событий тех, которые интересуют исследователя) устанавливают в режиме dot plot, где по оси х отложены значения интенсивности прямого светорассеяния, а по оси у — интенсивности углового светорассеяния. С помощью окна дискриминации из анализа исключают разрушенные клетки и агглютинаты. На рис. 1, б, в — определение процента спонтанной АР (б) и индуцированной АР (в) в режиме contour plot, где по оси х отложены значения интенсивности зеленой флюоресценции (на проточном цитофлюориметре — ось Fl 1), а на оси у — значения красной флюоресценции (на проточном цитофлюориметре — ось Fl 2).
Для выяснения клинической значимости теста было проведено сравнение спонтанной и индуцированной АР, а также индуцируемости АР у фертильных мужчин (1-я группа) и у пациентов с бесплодием неясного генеза и нормозооспермией (2-я группа) (рис. 2).
Достоверных различий между уровнем спонтанной АР в указанных группах не выявлено. Установлено уменьшение процента индуцированной АР во 2-й группе по сравнению с 1-й группой (средние значения 30 и 38% соответственно; Р≤0,04). Индуцируемость АР была также существенно снижена у пациентов с бесплодием неясного генеза по сравнению с таковой у фертильных доноров (средние значения 24 и 35%; Р≤0,007).
В настоящее время наиболее используемым подходом для выяснения клинической значимости теста является построение характеристических (Receiver Operating Characteristics, ROC) кривых [15], позволяющее определять диагностическую значимость анализа и вычислять значения параметра, при которых диагностическая ценность теста максимальна.
Значения чувствительности, специфичности и диагностической значимости теста при выявлении бесплодия, обусловленного нарушениями функций сперматозоидов, получали с помощью построения характеристических кривых в программе MedCalc.
Была выявлена высокая специфичность и диагностическая значимость оценки всех трех параметров акросомного статуса — спонтанной АР (97 и 91% соответственно), индуцированной ионофором АР (94 и 88%), индуцируемости АР (97 и 94%). Относительно невысокие значения чувствительности при оценке спонтанной АР (21%, cut-off >14%), АР, индуцированной ионофором (31%, cut-off ≤21%), и индуцируемости АР (32%, cut-off ≤12%) связаны с тем, что лишь у части пациентов бесплодие может быть обусловлено только нарушениями акросомного статуса. Вероятно, что с развитием современных методов диагностики будут обнаружены и другие патогенетические факторы бесплодия. В то же время высокая специфичность и диагностическая ценность предлагаемых параметров теста позволяют использовать его для выявления пациентов с нарушением акросомного статуса, значительно уменьшая при этом число диагнозов «бесплодие неясного генеза».
Предлагаемые нами значения параметров акросомного статуса, при которых диагностируется мужское бесплодие, отличаются от соответствующих показателей, предложенных Европейским обществом репродукции и эмбриологии человека [13], однако в этих рекомендациях приводят лишь нормативные значения индуцированной АР, определяемой методом иммунофлюоресценции, которые не должны превышать 15%, и спонтанной АР, которая не должна быть выше 20%, и не указана их диагностическая ценность. Необходимо учитывать, что интерпретация результатов даже рутинного анализа спермы — спермограммы — остается неоднозначной в диагностике бесплодия. Так, недавно в рекомендациях ВОЗ были изменены нормативные показатели содержания морфологически нормальных сперматозоидов с50 до 30%, при этом не было дано ссылок на какие-либо дополнительные исследования. Методом, рекомендованным ВОЗ для выявления антиспермальных антител, является MAR-тест, однако за последние 20 лет эксперты ВОЗ трижды меняли границы нормы для этого теста — до 1992 г. Нормой являлось значение теста менее 40%, с 1992 г. — 10%, с 1999 г. — 50% [14].
Изменилась и терминология, используемая в рекомендациях ВОЗ, — показатели спермограммы, ранее называемые «нормальными» в последнем издании обозначены как «референсные» [14]. Очевидно, что диагностическая ценность критериев ВОЗ требует дополнительной проверки и клинического подтверждения.
Согласно нашим данным, наибольшей чувствительностью (32%) при диагностике бесплодия, обусловленного дисфункцией сперматозоидов, обладает оценка индуцируемости АР. Таким образом, предложенный метод позволяет эффективно диагностировать бесплодие, обусловленное дисфункцией сперматозоидов, у 32% бесплодных пациентов с нормальными показателями спермограммы и характеризуется высокой степенью стандартизации.
Полученные нами значения основаны на оценке акросомного статуса фертильных и бесплодных пациентов с помощью стандартизированных методов получения фракции активноподвижных сперматозоидов, их фиксации и окрашивания. ПЦМ является также объективным методом, позволяющим проводить быстрый анализ 5000 клеток одного образца и минимизировать ошибку метода при оценке АР.
Мы надеемся, что своевременная диагностика нарушений АР с помощью предлагаемых нами методов может стать важным звеном в обследовании пациентов с бесплодием неясного генеза. Использование ПЦМ для количественного анализа экспрессии рецепторов сперматозоидов, определяющих активность связывания гамет, и анализа АР в ответ на различные индукторы АР in vitro может иметь большое теоретическое и практическое значение для понимания молекулярных основ репродукции человека, диагностики бесплодия у мужчин и выбора оптимальных способов коррекции репродуктивной функции.
