Эндометриоз – процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию [1]. Это дисгормональное, иммунозависимое и генетически детерминированное заболевание, выявляемое у 10–15% женщин репродуктивного возраста, 30–50% которых бесплодны [2–4]. Считается, что одним из этиологических факторов, лежащих в основе снижения фертильности женщин при эндометриозе, является изменение рецептивности эндометрия в связи с появлением в нем молекулярных и структурных дефектов, что в свою очередь приводит к нарушению процесса имплантации. При этом эндометрий женщин, страдающих эндометриозом, может иметь нормальную гистологическую структуру, но содержать изменения на молекулярном уровне в период «окна имплантации» [5]. Наиболее изученным морфологическим маркером сохранной рецептивности эндометрия являются структурные образования в виде выпячиваний апикальной части эпителия поверхностного эндометрия, называемые пиноподиями [6]. Развитие пиноподий ассоциировано с увеличением экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ) и его рецептора и интегрина αvβ3 в середину лютеиновой фазы менструального цикла [7]. В течение преимплантационного периода в тканях эндометрия присутствует широкий спектр цитокинов, наиболее изученным из которых является ЛИФ. Данный цитокин продуцируется эндометрием в течение всего менструального цикла, однако уровень его значительно выше в секреторную фазу цикла. В свою очередь бластоциста имеет на своей поверхности специфические ЛИФ-рецепторы: LIF-R и gp130, что свидетельствует о возможном механизме взаимодействия эмбриона и эндометрия [8]. Отмечается корреляция экспрессии ЛИФ и его рецептора с присутствием пиноподий на поверхности эндометрия человека, при этом максимальная экспрессия цитокина и рецептора совпадает со стадией расцвета пиноподий [9].
Интегрины – это трансмембранные гликопротеины, состоящие из двух нековалентно связанных α и β-субъединиц. В эндометрии человека экспрессируются три интегрина: α1β1, α4β1 и αvβ3. Считается, что только αvβ3 появляется на люминальной поверхности эпителиальных клеток эндометрия, первым взаимодействующего с трофобластом в период «окна имплантации», и продолжает экспрессироваться во время беременности. На поверхности эмбриона также выявлен интегрин αvβ3, что указывает на его явную роль в процессе имплантации [10]. По данным некоторых авторов пик выработки интегрина αvβ3 четко совпадает с наличием зрелых пиноподий [8].
Гликоделин А – гликопротеин из группы плацентарных белков также рассматривают как один из маркеров рецептивности эндометрия, чья экспрессия связана с уровнем прогестерона и функцией желтого тела. Гликоделин А появляется на поверхности эндометрия во время «окна имплантации», продолжает экспрессироваться в первом триместре беременности и обладает мощной иммуносупрессорной активностью, обеспечивая локальное подавление иммунного ответа матери на развивающийся эмбрион [10].
НОХА-10 – белок гена из семейства НОХ-генов, содержащего гомеобокс (последовательность ДНК, кодирующая факторы транскрипции). НОХА-10 участвует в пролиферации, дифференцировке клеток и воздействует на рецептивность эндометрия. Экспрессия НОХА-10 значительно возрастает в среднюю и позднюю секреторную фазу менструального цикла и регулирует образование пиноподий и активность продукции интегрина αvβ3 и IGFBP1 [11]. По данным ряда авторов, снижение экспрессии НОХА-10 в период «окна имплантации» у женщин с эндометриозом приводит к снижению частоты имплантации [12, 13].
Известно, что эндометриоз является эстроген-зависимым заболеванием, а метаболическая активность эстрогенов модулируется посредством особых ферментных систем, принадлежащих к цитохромам Р450. Было выявлено, что в эутопическом эндометрии лютеиновой фазы цикла пациенток с наружным генитальным эндометриозом уровень мРНК ароматазы выше, чем у пациенток без данного заболевания [14]. В исследовании группы авторов выявлено повышение экспрессии ароматазы цитохрома Р450 в эктопическом и эутопическом эндометрии при наружном и внутреннем эндометриозе по сравнению с контролем [15].
Все вышеизложенное указывает на возможное влияние указанных маркеров рецептивности эндометрия на процесс имплантации.
Целью данного исследования явилось изучение морфологического и молекулярного субстрата нарушения рецептивности эндометрия у бесплодных пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ), вступающих в программу вспомогательных репродуктивных технологий.
Материал и методы исследования
На базе ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России было исследовано 148 образцов биоптата эндометрия бесплодных женщин: у 50 – с НГЭ 1–2-й стадии, верифицированным при лапароскопическом лечении в отделении оперативной гинекологии (исследуемая группа); у 44 – с эндометриоидными кистами яичников (ЭКЯ) (группа сравнения) и у 54 – с трубно-перитонеальным фактором бесплодия (ТПФ) (контрольная группа). Всем пациенткам были проведены лапароскопические органосохраняющие операции: пациенткам с НГЭ – удаление очагов эндометриоза; при выявлении ЭКЯ – резекция яичников в пределах здоровых тканей.
Критериями включения пациенток в исследование были: возраст женщин от 20 до 38 лет, регулярный менструальный цикл, наличие НГЭ 1–2-й стадии по пересмотренной классификации Американского общества фертильности, верифицированного при оперативном вмешательстве на органах малого таза и подтвержденного данными гистологического исследования (для исследуемой группы), наличие оперативных вмешательств на яичниках по поводу эндометриоидных кист (для группы сравнения), отсутствие других гинекологических заболеваний, влияющих на репродуктивную функцию и рецептивность эндометрия (хронический эндометрит, миома матки, синдром поликистозных яичников, синехии, гиперпластические процессы эндометрия, пороки развития матки, аденомиоз и др.), отсутствие гормонального лечения в течение 3 месяцев до проведения исследования.
Каждой пациентке проводился ультразвуковой мониторинг фолликулогенеза и функциональные тесты, фиксирующие пик лютеинизирующего гормона в моче с целью определения овуляции. Аспирационная пайпель-биопсия эндометрия проводилась под ультразвуковым контролем из области дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratoire C.C.D.», Франция) на 6–8-й день после овуляции. Материал биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. После обработки образцов по стандартной общепринятой унифицированной методике их помещали в парафин. Среды толщиной 4 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличении от х50 до х1000. Также проводилась оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х1000 в 5 полях зрения. Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3–4 мкм. Демаскировка антигенов ткани проводилась в ретривере PTLink фирмы Dako (Дания) в цитратном буфере рН=6,0 в течение 20 мин при температуре 96оС. Для визуализации реакций применяли систему выявления REALTMEnVisionTM («DAKO», Дания). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной сывороткой (нормальный мышиный иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера.
Для определения экспрессии ЛИФ использовали кроличьи поликлональные антитела в разведении 1:100 («Sigma», США). Определение уровня экспрессии гликоделина А осуществляли с использованием мышиных моноклональных антител в разведении 1:100 (клон 6F2 «Santa Cruz Biotechnology», США). Для определения экспрессии НОХА10 применяли кроличьи поликлональные антитела в разведении 1:200 («GenWay Biotech», США). Определение уровня экспрессии интегрина αvβ3 проводили с использованием мышиных моноклональных антител (клон 26С6) в разведении 1:100 («Gene Tex», США). Экспрессию ароматазы определяли с использованием кроличьих поликлональных антител в разведении 1:20 (CYP19A1 «Novus Biologicals», США). Результаты ИГХ-реакции для ЛИФ, гликоделина А, интегрина αvβ3, ароматазы и НОХА10 оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) – 0 баллов; менее 20% иммуноокрашенных клеток (±) – 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (±±) – 4 балла; более 40% окрашенных клеток (±±±) – 6 баллов [16, 17].
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы SPSS Statistics v. 17.0. (SPSS Inc.). Все полученные количественные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), ошибка среднего (m) , для качественных данных – частоты (%). Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок и многофакторный дисперсионный анализ (для нескольких независимых переменных). Сравнение непараметрических данных осуществляли с помощью критерия Манна–Уитни (для двух групп) для несвязанных совокупностей. Для определения различий между качественными показателями использовали метод χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления, которого прибегали к построению «сетки 2×2» и «3×2». Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95% уровень значимости).
Результаты исследования и обсуждение
Средний возраст пациенток с НГЭ 1–2-й стадии составил 33,68±0,685 года и статистически не отличался ни от среднего возраста пациенток с ЭКЯ (32,09±1,017 года; р=0,192), ни от среднего возраста пациенток контрольной группы (33,42±0,631 года; р=0,787). Длительность бесплодия в исследуемой группе была выше таковой в контрольной группе (5,96±0,670 против 4,97±0,589 года соответственно). Это, возможно, связано с длительным периодом диагностики НГЭ и неоднократными попытками хирургического и медикаментозного лечения НГЭ и бесплодия. У пациенток с НГЭ 1–2-й стадии и ЭКЯ бесплодие носило в основном первичный характер и составило 64 и 63,6% соответственно, в отличие от 34,2% случаев первичного бесплодия при ТПФ (р=0,025). Это подтверждает недостаточность хирургического и медикаментозного лечения НГЭ при первичном бесплодии у большинства пациенток.
Гистологическое исследование эндометрия. При гистологическом исследовании эндометрий пациенток исследуемой группы в 34 случаях (68%) соответствовал средней стадии секреции, в 16 случаях (32%) – ранней стадии секреции. В 24 (48%) образцах эндометрия отмечался очаговый склероз. При гистологическом исследовании эндометрий пациенток группы сравнения в 34 случаях (77,3%) соответствовал средней стадии секреции, в 10 случаях (22,7%) – ранней стадии секреции. В 24 (54,5%) образцах эндометрия отмечался очаговый склероз. Гистологическая картина эндометрия пациенток контрольной группы в 42 (73,7%) случаях соответствовала средней стадии секреции, в 15 случаях (26,3%) – ранней стадии секреции. Признаки очагового склероза во всех образцах отсутствовали. При сравнении состояния эндометрия во всех группах не было выявлено статистически значимых различий в частоте встречаемости разных стадий развития эндометрия (р=0,768), однако частота выявления очагового склероза была значимо ниже у пациенток контрольной группы (р<0,05). В поверхностном эпителии эндометрия оценивалось количество пиноподий (рис. 1а, б, в, рис. 2а, см. на вклейке). У пациенток с НГЭ (исследуемая и группа сравнения) количество пиноподий было значимо ниже, чем в контрольной группе (25,32±3,169 и 15,09±3,076 против 36,43±1,639, соответственно р=0,039 и р=0,001). Следует отметить, что в группе пациенток с НГЭ 1–2-й стадии количество пиноподий было достоверно выше, чем в группе пациенток с ЭКЯ (р=0,026).Таким образом, эндометрий пациенток с бесплодием при НГЭ (исследуемая группа и группа сравнения) и контрольной группы существенно различались между собой по количеству пиноподий и частоте формирования очагового склероза. При этом при НГЭ 1–2-й стадии количество пиноподий было значимо выше, чем при ЭКЯ (р<0,05). Для пациенток контрольной группы характерна низкая частота формирования очагового склероза и высокий уровень эндометриальных пиноподий.
Иммуногистохимическое исследование эндометрия. ЛИФ. У пациенток с НГЭ как исследуемой группы, так и группы сравнения уровень экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия был значимо ниже по сравнению с контрольной группой и составил 4,8±0,327 и 4,2±0,696 балла против 5,71±0,286 балла соответственно (р=0,048 и р=0,025) (рис. 1 г, д, е, рис. 2б, см. на вклейке). Причем самый низкий уровень экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у пациенток с ЭКЯ. Уровень экспрессии ЛИФ в железистом эпителии и строме эндометрия во всех группах значимо не отличался и составил для исследуемой группы 1,8±0,696 и 1,0±0,680 балла, для группы сравнения 2,9±0,706 и 1,8±0,757 балла, для контрольной группы по 0,57±0,369 балла соответственно.
НОХА10. У пациенток с НГЭ в исследуемой группе и в группе сравнения уровень экспрессии НОХА10 в поверхностном эпителии эндометрия был ниже чем в контрольной группе и составил 3,4±0,442 и 1,8±0,442 балла против 4,0±0,436 балла соответственно (рис. 1ж, з, и, рис. 2в, см. на вклейке). Причем достоверно самый низкий уровень экспрессии НОХА10 в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у пациенток с ЭКЯ по сравнению с пациентками с НГЭ 1–2-й стадии и ТПФ (р=0,036 и р=0,008). Уровень экспрессии НОХА10 в железистом эпителии и строме эндометрия у пациенток с НГЭ значимо не отличался от контрольной группы и составил для исследуемой группы 0,8±0,306 и 1,0±0,521 балла, для группы сравнения 1,0±0,422 и 0,4±0,200 балла, для контрольной группы 1,71±0,808 и 0,86±0,595 балла соответственно. Однако отмечался значимо низкий уровень экспрессии рецепторов к НОХА10 в строме эндометрия в группе пациенток с ЭКЯ по сравнению с пациентками с НГЭ 1–2-й стадии (р=0,049).
Интегрин αvβ3. У пациенток с НГЭ в исследуемой группе и в группе сравнения уровень экспрессии интегрина αvβ3 в поверхностном эпителии эндометрия был ниже по сравнению с контрольной группой и составил 1,5±0,367 и 0,7±0,423 балла против 2,43±0,429 балла соответственно (рис. 2г, рис. 3а, б, в, см. на вклейке). Причем достоверно самый низкий уровень экспрессии интегрина αvβ3 в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у пациенток с ЭКЯ по сравнению с пациентками с НГЭ 1–2-й стадии и пациентками с ТПФ (р=0,042 и р=0,009). Уровень экспрессии интегрина αvβ3 в железистом эпителии эндометрия исследуемой группы и группы сравнения значимо не отличался и составил 0,2±0,200 и 0,1±0,100 балла соответственно (р>0,05). Экспрессия интегрина αvβ3 в строме эндометрия наблюдалась только в исследуемой группе и составила 0,2±0,427 балла. В контрольной группе отсутствовала экспрессия данного маркера как в железистом эпителии, так и строме эндометрия.
Гликоделин А. У пациенток с НГЭ как в исследуемой группе, так и в группе сравнения уровень экспрессии гликоделина А в поверхностном эпителии эндометрия был значимо ниже по сравнению с контрольной группой и составил 1,0±0,327 и 0,9±0,300 балла против 1,71±0,286 балла соответственно (р=0,049 и р=0,036) (рис. 2д, рис. 3г, д, е, см. на вклейке). Причем самый низкий уровень экспрессии гликоделина А в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у пациенток с ЭКЯ. Уровень экспрессии гликоделина А в железистом эпителии эндометрия во всех группах достоверно не различался и составил в исследуемой группе 0,5±0,269 балла, в группе сравнения 0,4±0,306 балла, в контрольной группе 0,57±0,369 балла. В строме эндометрия во всех исследуемых группах экспрессия гликоделина А отсутствовала.
Ароматаза. Установлено, что у пациенток с НГЭ (как в исследуемой, так и в группе сравнения) уровень экспрессии ароматазы в поверхностном эпителии, железах и строме был значимо выше по сравнению с контрольной группой (р<0,05), что коррелирует с уровнем экспрессии эстрогеновых рецпторов (ЭР)-α, описанного ранее [15]. При этом максимальный уровень экспрессии рецепторов к ароматазе наблюдался у пациенток с ЭКЯ. Так экспрессия ароматазы в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия в группе сравнения составила 5,8±0,200, 4,8±0,327 и 4,4±0,400 балла соответственно, в исследуемой группе – 5,6±0,267, 4,0±0,422 и 3,6±0,499 балла, в контрольной группе – 3,71±0,286, 1,86±0,404 и 2,0±0,378 балла соответственно (рис. 2е, рис. 3ж, з, и, см. на вклейке).
Анализируя полученные данные, следует отметить, что при НГЭ имеются изменения в экспрессии морфологического маркера рецептивности эндометрия – пиноподий, ряда молекулярных маркеров рецептивности эндометрия (ЛИФ, НОХА10, интегрина αvβ3, гликоделина А и ароматазы). При этом степень выраженности данных изменений коррелирует с тяжестью заболевания НГЭ. Так при ЭКЯ в поверхностном эпителии эндометрия по сравнению с контрольной группой отмечается снижение экспрессии ЛИФ, НОХА10, интегрина αvβ3 и гликоделина А. При НГЭ 1–2-й стадии экспрессия данных маркеров также снижена, однако статистической значимости достиг уровень экспрессии ЛИФ и гликоделина А. Кроме того, выявлено, что изменения экспрессии маркеров рецептивности эндометрия в основном наблюдались в поверхностном эпителии эндометрия, который первым вступает в «диалог» с бластоцистой в полости матки, то есть эти изменения могут являться причиной нарушения процесса имплантации при НГЭ. Известно, что на рецептивность эндометрия оказывает влияние циклическая секреция гормонов яичника. Так, уровень ЭРα повышается в пролиферативную фазу менструального цикла под действием эстрогена и снижается в секреторную фазу цикла в ответ на влияние прогестерона. В норме отмечается снижение уровня как ЭРα, так и прогестероновых рецепторов (ПР)-А в период «окна имплантации» [17].
Нами было выявлено достоверное повышение уровня экспрессии ЭРα и ароматазы в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия бесплодных пациенток с НГЭ 1–2-й стадии и ЭКЯ, что может быть одним из патогенетических механизмов как снижения рецептивности эндометрия, так и прогрессирования эндометриоза. Известно, что сочетание высокого уровня эстрадиола и ЭРα при эндометриозе стимулирует пролиферацию эндометрия, изменяет нормальный характер генной экспрессии и снижает имплантационную способность эндометрия. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать о фундаментальных отличиях эндометрия бесплодных пациенток с НГЭ от эндометрия женщин без данного заболевания.
Заключение
На основании гистологического и иммуногистохимического исследований биоптатов эндометрия 148 бесплодных пациенток с верифицированным при лапароскопическом лечении в отделении оперативной гинекологии диагнозом НГЭ 1–2-й стадии, ЭКЯ и ТПФ получено, что у пациенток с бесплодием, сочетающимся с НГЭ, происходит нарушение рецептивности эндометрия в период «окна имплантации». Это проявляется в снижении количества пиноподий, дисбалансе гормональных рецепторов, снижении ряда молекулярных маркеров рецептивности эндометрия. Особенностью изменения эндометрия в период «окна имплантации» при НГЭ является достоверно более высокий уровень экспрессии ЭРα в эпителии и ароматазы в поверхностном эпителии, железах и строме. Также у бесплодных пациенток с НГЭ в поверхностном эпителии эндометрия в период «окна имплантации» происходит снижение таких маркеров рецептивности эндометрия, как ЛИФ, НОХА10, гликоделин А, интегрин αvβ3. При этом выраженность этих изменений коррелирует с тяжестью НГЭ и наиболее выражена у бесплодных пациенток с ЭКЯ.
Таким образом, изменение рецептивности эндометрия может являться одной из ведущих причин бесплодия и более низкой эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с НГЭ.
