Integrative evaluation of menstrual blood biomarkers in the diagnosis of endometrial non-tumor pathology

Маточный фактор является самостоятельной причиной в генезе репродуктивных потерь. В этой связи патология слизистой оболочки матки играет ключевую роль в реализации женской детородной функции [1–6]. Чаще всего неопухолевая патология эндометрия развивается вследствие персистирующего воспаления в полости матки. Однако важно понимать, что в большинстве случаев имеют место сочетанные этиологические и патогенетические факторы, причем одни нередко являются следствием других. Таким образом, неопухолевая патология эндометрия обусловливает невынашивание, бесплодие, неудачные попытки вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), осложнения гестации [7–12].

Основными методами диагностики патологии полости матки являются гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия, патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия [6, 7, 12, 13].

В настоящее время продолжается разработка методов, позволяющих улучшить диагностику состояния эндометрия. Одним из перспективных способов оценки выраженности патологического процесса в эндометрии представляется комплексное исследование менструальных выделений, поскольку они являются непосредственным отделяемым субстратом из предполагаемого очага патологического процесса [6, 14–18]. Однако, ранее предложенные методы не лишены недостатков, и наиболее существенным из них является сомнительная эффективность и прогностическая значимость известных способов ввиду того, что проводится оценка одного единственного или сочетания однотипных по своему биологическому значению показателей, что не отражает других звеньев патогенеза патологического процесса в ткани и не позволяет определить прогноз развития патологии эндометрия.

Существует ряд лабораторных параметров, которые ввиду их биологической роли и простоты определения наиболее оптимальны для тестирования в образце менструальной крови. К ним можно отнести ферменты антиоксидантной системы, цитокины и молекулы адгезии. Это позволило бы оценить выраженность воспалительной реакции, оксидативного стресса, микроциркуляторных нарушений, эндотелиальной дисфункции.

Цель исследования: повышение точности и объективности диагностики состояния эндометрия и прогнозирование неопухолевой патологии эндометрия у пациенток с отягощенным репродуктивным анамнезом.

Материал и методы исследования

Были обследованы 96 пациенток детородного возраста, заинтересованных в беременности. Средний возраст составил 34±2,5 лет.

Критериями включения в исследование стали: репродуктивный возраст пациенток, наличие в анамнезе бесплодия, привычного невынашивания беременности, безуспешных попыток ВРТ, гистологически верифицированный диагноз неопухолевой патологии эндометрия.

В качестве критериев исключения из исследования были приняты эхографические признаки миомы матки и аденомиоза, наличие системных хронических заболеваний, а также применение антимикробных препаратов в течение последних 3 месяцев.

Пациентки с репродуктивными нарушениями в анамнезе прошли стандартное обследование в соответствии с современными рекомендациями. В числе прочих обследований проводили забор менструальной крови для определения глутатионпероксидазы-1 (Gpx-1), интерлейкина-6 (IL-6) и растворимого Е-селектина (sELAM) при включении в исследование и через 2,5–3 месяца после лечения, гистероскопию с пайпель-биопсией и гистологическим исследованием эндометрия. Менструальную кровь для исследования забирали в самый обильный, как правило, второй, день менструации. Пациентку размещали на гинекологическом кресле, вводили вагинальное зеркало по общепринятой методике, избегая контакта внутренней его поверхности с вагинальным отделяемым. Кровь изливалась самопроизвольно, скапливаясь в ложке зеркала, затем ее аккуратно сливали или аспирировали с помощью пипетки, помещали в пластиковую пробирку Эппендорфа и доставляли в лабораторию. Пробирку центрифугировали в течение 15 мин при 6000 об/мин в центрифуге «MINISPIN PLUS EPPENDORF». Определение IL-6 проводили на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе «IMMULITE 1000» (США), Gpx-1 и sELAM – на микропланшетном фотометре «Multiskan FC» (Финляндия). Определение данных параметров было основано на иммуноферментном твердофазном «сэндвич»-методе с использованием специфических моноклональных антител.

С целью определения нормативных показателей была исследована менструальная кровь 30 здоровых женщин-добровольцев репродуктивного возраста, у которых в анамнезе не было указаний на инвазивные внутриматочные вмешательства, инфекционно-воспалительные заболевания органов малого таза, системную патологию, эндокринно-обменные нарушения и опухолевые процессы.

Лаборатория, в которой проводили исследования менструальной крови, в течение многих лет участвует в программе Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (№ 08952 в реестре ФСВОК).

На базе кафедры вычислительной математики и кибернетики федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» была выполнена математическая обработка результатов для определения прогноза неопухолевой патологии эндометрия.

Для анализа и предсказания результатов был выбран метод логистической регрессии [19]. На основе анализа параметров менструальной крови была разработана программа, которая выдавала коэффициенты для формулы логистической регрессии:

где Х3 – IL-6 (нг/мл), Х2 – sELAM (нг/мл), Х1 – Gpx-1 (пг/мл)

a=0,0002782; b=0,0381529; c=-0,1205126; d=-1,1189533; e (экспонента)=2,7.

На вход формулы подаются результаты анализов пациентки (параметры менструальной крови: Gpx-1, IL-6 и sELAM), а на выходе представлена вероятность наличия заболевания.

Для однозначного определения пациента в одну из двух групп, больных или здоровых, был также вычислен порог cutt_off≥0,29. Если вычисленное значение P, по формуле (1), выше порога, пациентка относится в группу больных; если вероятность заболевания P меньше вычисленного порога, относим пациента в группу здоровых. Критерием выбора порога отсечения было задано требование максимальной суммы чувствительности и специфичности.

Оценка полученной регрессионной модели была проверена путем построения ROC – кривой. Полученные результаты говорят о ее отличном качестве, о чем свидетельствует показатель AUC=0,9714, а значит, предложенное уравнение может быть использовано для оценки вероятности развития болезни.

Результаты исследования и обсуждение

Референсные значения (нормы), определенные у здоровых женщин-добровольцев, составили: для Gpx-1: 4-310 нг/мл, для sЕLAM: 4-27 нг/мл, для IL-6: 500-3000 пг/мл. Средние значения указанных параметров у здоровых и больных представлены в таблице.

На основе разработанной математической модели при пороговом значении cutt_off≥0,29 оценивали состояние эндометрия как неудовлетворительное, что позволяло предположить патологию эндометрия. В качестве контрольного метода использовали данные гистологического исследования эндометрия. Изменения уровней биомаркеров были достоверными у пациенток до и после проведенного курса лечения, включавшего дифференцированное назначение антимикробных препаратов, дезагрегантов, прогестерона и физиопроцедур (рис. 1).

Вычисленная средняя вероятность заболевания (Рср.) по обследованным больным составила 0,59, по здоровым – 0,22. Диагностическая чувствительность данного теста составила 93,3%, специфичность – 92,86%.

В целом результаты исследования продемонстрировали высокую положительную прогностическую ценность предложенного теста – 97,6% и отрицательную прогностическую ценность на уровне 69,5%, что было подтверждено стандартными гистероскопическими и морфологическими критериями после забора биоптата эндометрия. Так, у большей части пациенток с диагностически значимыми уровнями Р отмечены признаки хронического воспаления по различным вариантам, в ряде случаев –дистрофические изменения в ткани. Измерение вышеописанных биомаркеров менструальной крови и вычисление показателя вероятности патологии эндометрия в динамике после курса лечения позволило оценить эффективность проведенных терапевтических мероприятий, при необходимости оптимизировать лечебную тактику и прогнозировать восстановление репродуктивной функции у пациенток с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (рис. 2).

Обсуждая полученные результаты, полагаем, что у женщин с репродуктивными неудачами в анамнезе (бесплодие, привычное невынашивание беременности, самопроизвольный выкидыш) для четкого обоснования показаний к проведению инвазивных внутриматочных вмешательств, а также последующей этиопатогенетической терапии на этапе прегравидарной подготовки, наряду с традиционными лабораторно-инструментальными методами диагностики целесообразно использовать определение глутатион-пероксидазы-1, интерлейкина-6 и Е-селектина в менструальных выделениях, а также интегративного показателя Р с целью вычисления вероятности патологии эндометрия. Предложенный способ безопасен и позволяет повысить точность и информативность оценки состоятельности эндометрия при его дисфункции, а также прогнозировать восстановление морфо-функционального потенциала эндометрия после лечения.

Описанный метод запатентован (Патент на изобретение № 2646473 от 05.03.2018 г.).

Заключение

Вычисление прогностической вероятности на основе измерения концентрации биологически активных веществ в менструальных выделениях целесообразно для первичной неинвазивной диагностики неопухолевой патологии эндометрия, а также для динамической оценки эффективности его лечения. Ценность предлагаемого способа состоит в том, что он информативен, прост в исполнении, легко воспроизводим, не требует инвазивных вмешательств для забора исследуемого материала и существенных экономических затрат. Все вышеперечисленное позволяет рекомендовать его к широкому внедрению в лабораторно-клиническую практику. Использование теста менструальных выделений поможет четко обосновать необходимость внутриматочных вмешательств и минимизировать риск ятрогении.