Процесс имплантации эмбриона до сих пор остается не до конца изученным этапом, лимитирующим частоту успешных исходов циклов ЭКО [1]. Несомненно, что результативность циклов ЭКО во многом зависит от адекватной готовности эндометрия к имплантации эмбриона, от качества перенесенного эмбриона в полость матки и от синхронности их взаимодействий в период окна имплантации. На ранних этапах имплантации между эмбрионом и эндометрием происходят различные молекулярные взаимодействия, которые опосредуются рядом цитокинов, хемокинов, факторов роста, молекул адгезии и их рецепторов, определяющих регуляцию дифференцировки, адгезии и инвазии трофобласта. Таким образом, поиск предиктивной оценки имплантационной способности эндометрия является актуальной задачей. Для достижения этой цели применялись различные методы исследования и получены противоречивые результаты [2–9]. Биопсия эндометрия на сегодняшний день остается наиболее распространенным методом получения материала, который после соответствующей обработки может быть исследован на различные иммуногистохимические маркеры. Кроме того, существуют данные, что выполнение биопсии эндометрия в цикле, предшествующем переносу эмбриона, благотворно влияет на результат лечения в программе ЭКО за счет стимулирующего действия местного повреждения на выработку цитокинов [10]. Среди наиболее важных факторов, участвующих в процессе имплантации, выделяют лейкемия-ингибирующий фактор (LIF), трансформирующий фактор роста β1 (TGF-β1) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).
Целью исследования было изучение экспрессии LIF, TGF-β1 и VEGF в поверхностном и железистом эпителии, а также в стромальном компоненте эндометрия посредством иммуногистохимического (ИГХ) анализа.
Материал и методы исследования
Морфологические и ИГХ-особенности эндометрия были проанализированы у 48 женщин, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО с последующим переносом эмбрионов в полость матки на базе ФГБУ НИИ АГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН. В зависимости от исхода лечения ретроспективно были сформированы 2 группы. В I группу вошли 23 (47,92%) женщины с эхографически подтвержденной беременностью, II группа состояла из 25 (52,08%) женщин, у которых беременность не наступила. Возраст женщин колебался от 24 до 35 лет. Уровень фолликулостимулирующего гормона в крови, определенный на 3–5-й день менструального цикла (д.м.ц) у всех обследованных женщин не превышал 11 МЕ/л, при ультразвуковом исследовании на 3–5-й д.м.ц определялось от 7 до 12 антральных фолликулов в максимальном эхографическом срезе яичников. Всем женщинам проводился стандартный протокол ЭКО или ЭКО с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов (ИКСИ) с применением антагонистов гонадотропин-рилизинг гормона. Для поддержки лютеиновой фазы цикла применялся микронизированный прогестерон (крайнон, Serono; утрожестан, BESINSHEALTHCARE). Проводили перенос только морфологически качественных эмбрионов на 4-е или 5-е сутки культивирования. Оставшиеся эмбрионы были криоконсервированы методом витрификации. Диагностика беременности проводили путем определения хорионического гонадотропина человека в крови на 14-й день после переноса эмбрионов в полость матки и подтверждали ультразвуковым исследованием на 21-й день.
Биопсию эндометрия выполняли в период предполагаемого окна имплантации на 20–23-й д.м.ц в цикле, предшествующем циклу ЭКО, с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier (Jiangsu Suyun Medical Materials Co., Ltd., КНР). Овуляция подтверждалась ультразвуковым методом и путем определения пика лютеинизирующего гормона в моче. Полученные образцы эндометрия обрабатывали по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ-исследование проводилось на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4–6 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Уровень экспрессии LIF в эндометрии определяли с использованием Abcam, Rabbit polyclonal Anti-LIF antibody (ab135629) разведение 1:100, уровень экспрессии VEGF-А определяли с использованием Abcam, Monoclonal Mouse Anti-VЕGF-А antibody (ab28775) разведение 1:50, для TGF-β1 использовались «Novocastra» Monoclonal Mouse Anti-Transforming Growth Factor Beta в разведении 1:40.
Исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Морфология 5.2. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 400+. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых молекул.
Статистическая обработка данных выполнена с использованием стандартного пакета Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows версия 6.0, StatSoft Inc. (США). Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли ранговый U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95% уровень значимости) и р<0,01 (99% уровень значимости). Для выявления наиболее значимых показателей, определяющих исход цикла ЭКО, была проведена процедура пошагового дискриминантного анализа, в составе переменных которой были включены относительная площадь и оптическая плотность экспрессии всех трех исследуемых факторов во всех структурах эндометрия.
Результаты исследования
Данные анамнеза достоверно не отличались у женщин обеих клинических групп (р>0,05). Средний возраст пациенток составил 30,40±0,46 года, средний индекс массы тела – 24,06±0,48. Избыточная масса тела была отмечена у 20 (41,66%) женщин. Продолжительность бесплодия варьировала от 1,5 до 14 лет, в среднем составила 5,17±0,38 года. Впервые лечение бесплодия с применением методов вспомогательной репродуктивной технологии проводилось у 33 (68,75%), повторно – у 15 (31,25%) женщин. Были установлены следующие факторы бесплодия: трубно-перитонеальный – у 25 (52,08%) женщин, мужской – у 23 (47,92%), у 12 (25%) имело место бесплодие в результате наружного генитального эндометриоза I–II степени. Сочетание факторов бесплодия имелось у 14 (29,17%) женщин. У 12 (52,17%) пациенток первой группы и у 11 (44%) второй оплодотворение было проведено методом ИКСИ в связи с наличием мужского фактора бесплодия. Средняя доза рекомбинантных гонадотропинов, количество полученных ооцитов и перенесенных эмбрионов не отличались в исследуемых клинических группах. Осуществлялся перенос только морфологически качественных эмбрионов. Частота имплантации составила 34,52% (54/84). Частота наступления беременности составила 47,92% (23/48). У 6 женщин (26,08%) наступила беременность двойней. У четырех женщин (17,39%) была выявлена неразвивающаяся беременность на ранних сроках. Беременность прогрессирует у 12 женщин (52,17%) и соответствует третьему триместру беременности. У 7 женщин (30,43%) беременность закончилась родами, среди которых у двух (28,57%) наступили преждевременные роды.
Экспрессия LIF в ткани эндометрия отмечалась в основном поверхностным и железистым эпителием и в меньшей степени – в строме эндометрия (рис. 1, 2 см. на вклейке). В среднем относительная площадь экспрессии в поверхностном и железистом эпителии в 54 раза превышала площадь экспрессии LIF в строме (10,92±0,73 и 0,20±0,01 соответственно). Оптическая плотность экспрессии LIF поверхностным эпителием в среднем превышала в 20 раз оптическую плотность в строме (1,201±0,318 и 0,060±0,014 соответственно).
Относительная площадь экспрессии LIF в железистом и поверхностном эпителии эндометрия была достоверно выше у женщин I группы и в среднем составила 12,86±1,03% в сравнении с женщинами II группы – 9,13±0,93% (р<0,05) (рис. 3). Относительная площадь экспрессии LIF в строме эндометрия была значительно выше у женщин I группы и в среднем составила 1,65±0,45 по сравнению с женщинами II группы – 0,9±0,45 (р<0,05).
У женщин I группы было отмечено значительное увеличение оптической плотности экспрессии LIF в железистом и поверхностном эпителии, и в среднем она составила 0,240±0,013 у.е. в сравнении с женщинами II группы – 0,168±0,008 у.е. (р<0,01) (рис. 4). У женщин с наступившей беременностью оптическая плотность экспрессии LIF в строме эндометрия была достоверно выше и в среднем составила 0,098±0,022 у.е. по сравнению с женщинами, у которых беременность в результате ЭКО не наступила – 0,027±0,013 у.е. (р<0,01).
Экспрессия VEGF-А отмечалась только в стромальном компоненте ткани эндометрия и отсутствовала в поверхностном и в железистом эпителии эндометрия (рис. 5, 6 см. на вклейке).
Относительная площадь экспрессии VEGF-А в строме эндометрия достоверно не отличалась у женщин обеих клинических групп (р>0,05).
Оптическая плотность экспрессии VEGF-А в строме эндометрия была достоверно выше у женщин с наступившей беременностью и в среднем составила 0,195±0,0132 у.е. в сравнении с женщинами у которых беременность не наступила – 0,143±0,012 у.е. (р<0,01) (рис. 7).
При ИГХ-окрашивании ткани эндометрия экспрессия TGF-β1 была выявлена в основном в железистом и поверхностном эпителии эндометрия и в меньшей степени – в строме. Обнаружена тенденция к увеличению относительной площади и оптической плотности экспрессии TGF-β1 у женщин с наступившей беременностью по отношению к результатам, полученным в группе женщин, у которых беременность в результате ЭКО не наступила. Однако исследуемые показатели не имели достоверных различий у больных исследуемых групп (р>0,05).
Была выявлена умеренная положительная корреляция между относительной площадью экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия (r=0,37, р<0,05), оптической плотностью экспрессии VEGF-A в строме эндометрия (r=0,40, р<0,05) и наступлением беременности. Более выраженная сопряженность была отмечена в отношении оптической плотности экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия (r=0,57, р<0,05) и наступлением беременности.
После проведения дискриминантного анализа, в который включали относительную площадь и оптическую плотность экспрессии LIF, VEGF-А и TGF-β1 в эндометрии, было выявлено, что оптическая плотность экспрессии LIF и VEGF-А в поверхностном и железистом эпителии эндометрия оказывает наиболее существенное влияние на наступление беременности в цикле ЭКО и позволяет предсказать вероятность ее наступления с точностью 72,92%.
Обсуждение
Иммунологическая теория имплантации впервые была провозглашена Tom Wegmann в 1993 г. [11] и с тех пор роль иммунологических факторов, в том числе цитокинов и факторов роста, в формировании иммунной толерантности во время имплантации и на протяжении беременности стало главной темой обсуждения в области репродуктивной иммунологии. Ткань эндометрия, полученная нами на 20–23-й день менструального цикла, предшествующего проведению ЭКО, может предоставить информацию о степени готовности эндометрия к имплантации бластоцисты в этот период времени и во время цикла ЭКО, несмотря на негативное влияние стимуляции суперовуляции на выработку эндометрием иммунологических факторов, необходимых для совершения процесса имплантации [12, 13]. Поиск маркеров, позволяющих прогнозировать рецептивность эндометрия в циклах ЭКО, является одной из важнейших и не до конца решенных на сегодняшний день задач. Нами была проведена попытка максимальной стандартизации исходных условий: все пациентки были раннего репродуктивного возраста, всем проводилось лечение бесплодия с применением одинаковых протоколов стимуляции суперовуляции, качество полученных ооцитов и перенесенных эмбрионов не отличалось, все полученные биоптаты эндометрия в период предполагаемого окна имплантации были ранней и средней стадии фазы секреции, а также обработка полученного материала и его оценка проводились стандартным методом с использованием одной компьютерной системы подсчета данных. Одними из важнейших факторов регуляции процесса адгезии и инвазии эмбриона признаны LIF [14, 15] и TGF-β [6, 16–18]. В период предполагаемого окна имплантации LIF появляется на поверхности пиноподий, где происходит первый контакт с трофобластом, который имеет на своей поверхности рецепторы к этому цитокину. Адекватная васкуляризация эндометрия необходима для совершения процесса имплантации. В этом процессе ключевая роль отводится VEGF-A. Считается, что именно он является основным ангиогенным фактором, регулирующим рост новых кровеносных и лимфатических сосудов в эндометрии человека [19–21]. Не менее важная роль принадлежит TGF-β, который участвует в регуляции толерантности иммунной системы матери к имплантируемому эмбриону, путем смещения Th1-иммунной реакции в сторону Th2, что обеспечивает иммунологически благоприятные условия для реализации процесса имплантации и прогрессирования беременности [22, 23].
Как уже было отмечено ранее, в период предполагаемого окна имплантации в поверхностном и железистом эпителии эндометрия и в меньшей степени в строме преобладает экспрессия LIF, VEGF-А и TGF-β1 [24–29], что соответствует и результатам нашего исследования. Эти данные позволяют сделать вывод о существенной роли перечисленных факторов в обеспечении полноценного процесса имплантации.
Отмечено снижение экспрессии LIF, VEGF-A и TGF-β1 в ткани эндометрия в период предполагаемого окна имплантации у женщин с идиопатическим бесплодием [18, 30, 31], неудачными попытками ЭКО и бесплодием, обусловленным эндометриозом [32, 33], а также у женщин с привычным невынашиванием беременности [34, 35] по сравнению с фертильными женщинами, что подтверждает их важность для благополучного наступления и прогрессирования беременности.
Оптическая плотность экспрессии LIF и VEGF-A в группе женщин с наступившей беременностью в результате ЭКО была гораздо выше (в 1,4 и в 1,3 раза соответственно), чем в группе женщин, у которых беременность не наступила, что отражает прогностическую ценность указанных параметров и согласуется с ранее полученными выводами других авторов [36, 37].
Таким образом, оценка оптической плотности экспрессии LIF и VEGF-A в эндометрии, отражающая интенсивность синтеза или накопления этих факторов, является наиболее эффективным прогностическим признаком в отношении исходов ЭКО.
По результатам нашего исследования у больных с наступившей после ЭКО беременностью также отмечалась тенденция к увеличению экспрессии TGF-β1 всеми структурами эндометрия, однако эти различия не были статистически достоверными. Поэтому, на наш взгляд, экспрессия TGF-β1 в структурах эндометрия не может являться прогностическим критерием имплантационной способности эндометрия.
В последние годы проводятся попытки использования рекомбинантных форм LIF и VEGF с целью улучшения качества эмбрионов и имплантационных свойств эндометрия [38, 39], однако на сегодняшний день их клиническое применение в естественных циклах и в циклах ЭКО остается ограниченным.
Выводы
1. При ИГХ окрашивании и оценке относительной площади и оптической плотности экспрессии исследуемых факторов выявлено, что LIF и TGF-β1 экспрессируются в период окна имплантации в основном в железистом и поверхностном эпителии эндометрия и в меньшей степени в строме, в то время как экспрессия VEGF-A отмечается в стромальном компоненте эндометрия.
2. В период предполагаемого окна имплантации экспрессия LIF в железистом и поверхностном эпителии эндометрия и VEGF-A в строме эндометрия у больных с последующей беременностью в результате ЭКО значительно (р<0,01) превышают эти показатели в эндометрии женщин с отсутствием имплантации.
3. Определение оптической плотности экспрессии LIF в железистом и поверхностном слоях и VEGF-А в строме эндометрия дает возможность прогнозировать наступление беременности в циклах ЭКО с вероятностью 72,92%.
