Одной из наиболее важных проблем в современной медицине, оказывающей отрицательное воздействие на репродуктивное здоровье женщины, обусловливающей высокие показатели перинатальной заболеваемости и смертности является невынашивание беременности [2, 4, 5, 15]. По данным многих авторов, частота данного осложнения, не имеющая тенденции к снижению на протяжении последних лет, составляет 10–25% от всех беременностей [6, 7]. В условиях демографического кризиса в России становится крайне актуальным создание оптимальных условий для сохранения здоровья женщины, а также решения вопросов рациональной тактики ведения беременности и родов [1, 9, 12].
Результаты фундаментальных исследований показали, что формирование внутриутробного страдания закладывается в ранние сроки гестации, когда неблагополучие организма женщины, состояние эндо- и миометрия обусловливают неполноценное формирование эмбриона, плода и внезародышевых структур [8].
Одним из основных факторов, приводящих к самопроизвольному аборту, является гормональный дисбаланс фетоплацентарного комплекса (ФПК) [10, 11, 13]. В настоящее время доказано, что адекватный иммунный ответ обеспечивается определенным гормональным гомеостазом, любые изменения которого приводят к нарушению нормальной иммунной реактивности [17,18]. Представляется необходимым более углубленное изучение особенностей функционирования иммунной системы с целью выявления закономерностей реализации перинатальных осложнений. В связи с этим приоритетной задачей, направленной на снижение репродуктивных потерь, детской заболеваемости и смертности, является предупреждение невынашивания беременности путем поиска cкрининговых маркеров, позволяющих выявить доклинические формы будущей патологии и предусмотреть меры, препятствующие ее дальнейшему распространению. Своевременная диагностика и разработка алгоритмов прогнозирования самопроизвольного аборта с учетом этиопатогенеза позволит доносить беременность до срока, снизить перинатальные потери, что и побудило нас к проведению настоящего исследования. Цель исследования: выявление патогенетически значимых изменений иммунной системы и разработка иммунологических критериев прогнозирования самопроизвольного аборта у пациенток с привычным выкидышем гормонального генеза с целью снижения частоты перинатальных осложнений.
Материал и методы исследования
Проведено обследование 116 женщин в ранние сроки беременности. Из них 59 с привычным выкидышем (N96 по Международной классификации болезней Х пересмотра) – основная группа и 57 женщин с физиологическим течением беременности – контрольная группа. Критериями отбора в основную группу явились привычный выкидыш гормонального генеза, отсутствие генетических, анатомических и инфекционных причин невынашивания.
Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, уровня экспрессии маркеров активации проводили с использованием реагентов фирмы Immunotex (Франция), FITC-меченых антител к CD3, CD4, CD8, CD16, СД19 и PE-меченых CD25, CD69, CD71, CD95, НLA-DR, CD124. Число лимфоцитов, вступивших в апоптоз, оценивали с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V(FITC) и пропидиум йодид (PI) (Caltag, США). Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США). Определение уровней интер-лейкина-12 (IL-12), IL-2, IL-4, IL-1β, фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерферона γ (IFN-γ) проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем Bender Medsistems (Австрия), IL-10 – с использованием тест-систем Biosource (США), активина-А – с использованием тест-систем DSL (США), неоптерина – с использованием тест-системы IBL (Германия). С целью оценки гормонального состояния ФПК беременных проводили определение уровня стероидных гормонов в сыворотке крови – эстриола, прогестерона, хорионического гонадотропина методом ИФА с использованием тест-систем «Алкор Био» (Россия) и DRG (США). Для формирования базы данных и при проведении статистического исследования использовались возможности табличного процессора Excel 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0). При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп при максимально допустимом уровне ошибки первого рода р=0,05. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену, при р<0,05 принималась гипотеза о наличии линейной связи. Формирование диагностических правил осуществлялось методом логитрегрессии.
Результаты исследования
Средний возраст женщин в основной группе составил 29,11±0,37 года, в контрольной – 28,20±0,63 года. При анализе менструальной функции у 27,1% пациенток основной группы выявлена первичная и вторичная олигоменорея (N91.3 и N91.4), у 10,2% пациенток – обильные, частые и нерегулярные менструации (N92.1). При изучении детородной функции пациенток основной группы первичное бесплодие было выявлено у 8,5% обследуемых, вторичное – у 3,39%. У 1,7% пациенток беременность наступила после проведения программы ЭКО, у 8,5% – на фоне заместительной гормональной терапии. В контрольной группе не было отмечено случаев нарушений менструального цикла, первичного и вторичного бесплодия, беременность у всех пациенток наступила спонтанно. В анамнезе у пациенток основной группы предыдущие беременности закончились самопроизвольным абортом в сроке 5–10 нед, что являлось одним из критериев включения в исследование. В контрольную группу были включены пациентки с отсутствием в анамнезе самопроизвольных абортов и преждевременных родов. В основной группе удельный вес перенесенных хронических воспалительных процессов гениталий составил 47,46% против 14,04% в контрольной группе (р<0,05). Анализируя влияние экстрагенитальной патологии на репродуктивную функцию женщин, в основной группе мы выявили большую распространенность заболеваний сердечно-сосудистой системы по сравнению с группой контроля (13,56 против 1,75%, р<0,05). Среди эндокринной патологии в основной группе у 52,54 % пациенток была выявлена гиперандрогения, у 23,73% – дисфункция яичников. Патологией щитовидной железы страдали 20,34% пациенток, ожирением – 13,56% обследованных. У беременных контрольной груп-пы эндокринная патология не выявлялась.
Сравнительный анализ особенностей течения беременности выявил, что у 16,95% женщин основной группы развился ранний гестоз, у 20,34% выявлено нарушение маточно-плацентарной гемодинамики. Среди пациенток контрольной группы беременность осложнилось ранним гестозом у 8,77 % женщин.
При изучении уровня стероидных гормонов было обнаружено достоверное снижение уровней эстриола и прогестерона в основной группе по сравнению с контрольной (1,1±0,2 против 2,0±0,1 и 94,2±6,2 против 140,3±12,2 соответственно).
Сравнительный анализ данных показал, что у беременных основной группы по сравнению с контрольной отмечались выраженные изменения показателей иммунного статуса в виде достоверного повышения числа лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами (58,7±1,2 и 44,4±2,2% соответственно), а также статистически значимое увеличение доли СD4+ лимфоцитов, экспрессирующих маркеры ранней активации CD69 и CD25 (1±0,2 и 0,2±0,01%; 0,8±0,01 и 0,5±0,01% соответственно), что является показателем активированного состояния Т-лимфоцитов. Аналогичные данные получены по содержанию лимфоцитов, экспрессирующих НLA-DR, характеризующих поздние этапы активации (9,8±0,6 и 6,4±0,9% соответственно), что служит показателем активности специфического иммунного ответа. Выявленные изменения можно объяснить тем, что основным продуктом специфических активированных Т-клеток является IFN-γ. Под его влиянием усиливается экспрессия молекул НLA-DR, обусловливая участие этих клеток в процессах антигенной презентации [3].
При анализе показателей NK-клеток (CD16+ лимфоцитов) в основной группе отмечено достоверное увеличение их относительного числа по сравнению с контрольной группой (10,6±0,9 и 6,1±0,5% соответственно), а также повышение числа NK-клеток, экспрессирующих маркер ранней активации CD25 на своей поверхности (0,5±0,07 и 0,1±0,01%), что отражает готовность к пролиферации, может приводить к накоплению популяций клеток с цитотоксической активностью и реализации литического потенциала. Наши данные согласуются с данными литературы о повышении содержания NK-клеток в периферической циркуляции у женщин с самопроизвольными абортами [14] и указывают на неблагоприятное влияние гормонального дисбаланса ФПК на иммунобиологический симбиоз матери и плода.
Изучение процессов поздней активации и готовности к апоптозу обнаружило тенденцию к снижению в общей популяции числа лимфоцитов, экспрессирующих CD95. Вместе с тем выявлено достоверное снижение числа СD4+ лимфоцитов, экспрессирующих СD95 антиген (0,2±0,01 и 0,4±0,01% соответственно), что, вероятно, свидетельствует о снижении готовности клеток к апоптозу. Данное предположение подтверждается полученными нами результатами о снижении доли клеток с ранним маркером апоптоза – Aннексин V+ (6,4±1,4 и 8,9±0,6 соответственно) по сравнению с контрольной группой.
Известно, что при нормальной беременности эстрогены угнетают клеточный иммунный ответ, обеспечивают альтерацию экспрессии цитокинов и цитокиновых рецепторов, модификацию эффекта цитокинов, подавляют литическую активность NK-клеток. Под действием прогестерона супрессируется продукция цитокинов, вызывающих воспалительные и тромбофилические реакции. Кроме того, прогестерон и его производные стимулируют в эндометрии продукцию протеинов, которые вызывают апоптоз естественных киллеров, а нарушение лютеиновой функции приводит к изменению уровней циркулирующего TNF-α [16]. В нашем исследовании содержание TNF-α в сыворотке крови в основной группе достоверно превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности (70±5,9 против 35±4,7 пг/мл). При корреляционном анализе выявлена обратная связь между содержанием TNF-α и уровнем прогестерона (r=0,62, p=0,02). Возможно, что повышение продукции TNF-α в сыворотке крови у беременных с гормональными нарушениями негативно влияет на формирование иммуносупрессии и провоцирует риск самопроизвольного аборта. Изучение содержания IL-12 выявило достоверное повышение показателей в основной группе по сравнению с контрольной (102±19,2 и 55,5±9,5 пкг/мл соответственно). Вероятно, что снижение уровня прогестерона приводит к появлению эффекта синергизма между IL-12 и TNF-α, вызывая доминирование цитокинов Th1 типа, приводя к прерыванию беременности. Аналогичные сдвиги характерны и для IL-1β (120±17,8 и 22±7,1 пг/мл соответственно). Негативное влияние повышенного уровня IL-1β может быть связано как с эмбриотоксическим эффектом, так и с активацией протромбиназы, что обусловливает угрозу самопроизвольного аборта и развитие плацентарной недостаточности.
В основной группе по сравнению с контрольной было отмечено повышение содержания IFN-γ в сыворотке крови (74,5±7,8 и 36,1±7,4 пг/мл). При корреляционном анализе обнаружена обратная связь между уровнем IFN-γ и содержанием эстриола (r=0,48, p=0,02). Вероятно, что дисбаланс гормонов ФПК способствует стимуляции сывороточного уровня IFN-γ, являясь фактором риска самопроизвольного аборта. С другой стороны, IFN-γ и TNF-α могут приводить к апоптозу клеток трофобласта, подавляют его гормональную функцию, нарушают инвазию и развитие.
Содержание IL-2 в основной группе составило 28,7±3,6 пг/мл, что превысило показатели контрольной группы в 1,7 раза. Напротив, содержание IL-10 было достоверно сниженным (4,6±0,4 против 8,5±1,3 пг/мл), что свидетельствует об изменении супрессорной реаранжировки и может приводить к срыву толерантности и прерыванию беременности. В то же время, содержание IL-4 в сравниваемых группах практически не различалось, однако у пациенток основной группы обнаружено достоверное снижение доли лимфоцитов, экспрессирующих CD124 (2,5±0,6 и 6,7±0,8% соответственно).
Отмечено достоверное повышение содержания активина-А в основной группе по сравнению с контрольной (11±4,7 против 4,2±0,2 пг/мл), что согласуется с исследованиями [19] о способности активина-А участвовать в воспалительном каскаде, активируя IL-1, TNF-α. Сходные сдвиги выявлены и для содержания неоптерина(3,2±0,1 и 1,8±0,1 нг/мл соответственно), что отражает активацию клеточного звена иммунной системы.
На основании сравнительного анализа соотношений про- и противовоспалительных цитокинов у пациенток основной группы было отмечено достоверное смещение баланса TNF-α/IL-10 (15,4±3,9 против 4,2±0,6), IFN-γ/IL-4 (1,3±0,1 и 0,7±0,06), IFN-γ/IL-10 (16,8±0,3 и 4,3±0,3), IL-8/IL-10 (7,4±1,2 и 3,5±0,3) в сторону продукции провоспалительных цитокинов.
В нашей работе в основной группе самопроизвольный аборт произошел у 12 женщин. Сравнительный анализ параметров иммунного статуса и функциональной активности лимфоцитов выявил статистически обоснованные различия между пациентками с прерванной и пролонгированной беременностью по содержанию лимфоцитов, экспрессирующих CD19 (12,3±1,3 и 7,4±0,8%), CD69 (5,2±0,4 и 2,2±0,5%), CD25 (3,7±0,2 и 0,6±0,1%), CD16+ клеток, экспрессирующих CD25 (0,6±0,01 и 0,2±0,09%), а также по уровню в сыворотке крови TNF-α (87±4,8 и 63,1±7,5 пг/мл) и IL-10 (3,8±0,4 и 6,5±0,6 пг/мл соответственно). На основании метода логистической регрессии была рассчитана чувствительность и специфичность для иммунологических маркеров, имеющих достоверные различия в нашем исследовании. Наиболее высокая чувствительность и специфичность выявлена для неоптерина, TNF-α в сыворотке крови, сочетания тестов CD4+ и CD16+. Были определены точки «Cutoff», позволяющие прогнозировать самопроизвольный аборт у пациенток с привычным выкидышем и гормональными нарушениями ФПК в I триместре с достаточно высокой степенью вероятности (рисунок).
Таким образом, выявленные иммунные сдвиги характеризуются нарушением процессов активации, дифференцировки, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток, свидетельствуют о модулирующем влиянии на их активность стероидных гормонов, подтверждая факт нарушения иммуногормонального гомеостаза и могут являться маркерами риска самопроизвольного аборта у пациенток с привычными потерями плода и гормональными нарушениями ФПК.
Использование клинико-иммунологических критериев позволило разработать алгоритм прогнозирования самопроизвольного аборта у пациенток с привычной потерей плода на фоне гормональных нарушений ФПК, что поможет выбрать адекватную и своевременную лечебную тактику, а также будет способствовать предупреждению развития перинатальных осложнений и увеличению количества благоприятных исходов беременности.
