Transforming growth factor-β expression in the ectocervical epithelial cells in cervical intraepithelial neoplasia and HPV infection

Samodelkin E.I., Kosareva P.V., Vetelina V.V.

Academician E.A. Vagner Perm State Medical University, Ministry of Health of Russia
Objective. To investigate cell-cycle regulation in the ectocervical epithelium in infection with HPV and in the development of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) by studying the expression of transforming growth factor-beta (TGFbs).
Materials and methods. The subject of the investigation was cervical biopsy specimens from 105 women, including 39, 24, and 12 patients with CIN I, II, and III, respectively (a study group); A comparison group included 30 HPV-infected patients without CIN. Immunohistochemical examinations were made in accordance with standard protocols using Diagnostic BioSystems reagents (USA).
Results. The expression of TGFbs was found in the ectocervical basal cells of patients in the comparison group and in the cells of basal, parabasal, and intermediate layers in the CIN I group, in the basal and parabasal layers in the CIN II group; TGFbs expression was absent in the majority of patients in the CIN III group. Quantification of TGFBs expression established that the latter in the ectocervical basal, parabasal, and intermediate layers was statistically significantly more pronounced in the HPV infection minus CIN group and the CIN I and CIN II groups than in the CIN III group.
Conclusion. As CIN progresses, the expression of TGFbs in the ectocervical epithelium at first increases and then decreases to the point of complete disappearance, which apparently suggest that the antiproliferative activity of the epithelium reduces by autocrine regulation.

Keywords

cervix uteri
epithelium
cell cycle proteins

Трансформирующий фактор роста бета (Transforming growth factor beta, TGFβs) – белок, который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток; выделяемый клетками во внеклеточную среду, существует в трех изоформах: TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 (TGFβs) [1]. TGFβs инициирует апоптоз в большинстве типов клеток и действует как антипролиферативный фактор в нормальных эпителиальных клетках и на ранних стадиях онкогенеза [2]. Некоторые клетки, секретирующие TGFβs, также имеют рецепторы для него; подобный механизм известен как аутокринная индукция [3].

В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс как в идентификации генов, нарушения функции которых ведут к развитию злокачественных новообразований, так и в выяснении роли кодируемых ими белковых продуктов. Гены, вовлеченные в регуляцию процессов клеточного цикла, дифференцировки, морфогенетических реакций и апоптоза, могут быть объединены в несколько сигнальных каскадов, изменения в которых в конечном итоге приводят к возникновению злокачественных новообразований; к числу таких факторов относится фактор роста семейства TGFβ [1]. TGFβ инициирует апоптоз в большинстве типов клеток и действует как антипролиферативный фактор в нормальных эпителиальных клетках и на ранних стадиях онкогенеза [2]. Тем не менее, прогрессия цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) в цервикальную карциному сопровождается снижением восприимчивости трансформированных клеток к антипролиферативному действию цитокинов семейства TGFβ [4]. Также все три изоформы TGFβ способствуют индукции синтеза провоспалительных цитокинов в эпителиальных клетках шейки матки [5]. В связи с этим анализ экспрессии TGFβ в эпителии шейки матки при предраковых процессах представляет определенный интерес.

Цель работы – исследование регуляции клеточного цикла в эпителии эктоцервикса при инфицировании вирусом папилломы человека (ВПЧ) и формировании CIN путем изучения экспрессии в эпителиальных клетках изоформы TGFβs.

Материал и методы исследования

Наблюдаемые пациентки амбулаторно-поликлинического приема в количестве 105 человек были выявлены при обследовании в ООО «Центр эстетической гинекологии», г. Пермь. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО ПГМУ имени академика Е.А. Вагнера Минздрава России. Каждая пациентка получала подробную информацию о проводимом исследовании и давала информированное согласие на участие в исследовании и публикацию его результатов в открытой печати. Критериями включения пациенток в исследование было: наличие аномальных кольпоскопических картин, а именно пунктуации и мозаики; неравномерная реакция на нанесение раствора уксусной кислоты и различный ее уровень; визуализация ацетобелого эпителия; визуализация атипических сосудов; обнаружение нетипичной ткани шейки матки, особенно легко ранимой; неровная поверхность ткани шейки матки (плюс ткань); наличие папиллярных разрастаний или изъязвлений; наличие лейкоплакии шейки матки.

Критерии исключения пациенток из исследования: наличие на момент обследования острых воспалительных заболеваний репродуктивных органов, беременность; хламидийная, цитомегаловирусная и герпесвирусная инфекции урогенительного тракта в стадии обострения; экстрагенитальные заболевания в стадии декомпенсации; инфекционный, аллергический, аутоиммунный и лимфопролиферативный синдромы; онкологические заболевания; прием антибактериальных, противовирусных и иммунотропных препаратов на протяжении последних 3 месяцев. При постановке диагноза руководствовались Инструкцией по применению «Алгоритмы ранней диагностики предрака и рака шейки матки» Министерства здравоохранения республики Беларусь от 27.04.2007 № 150-1106 (Минск, 2007), а также Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 2 октября 2009 г. № 808н «Об утверждении порядка оказания акушерско-гинекологической помощи».

Все исследования проведены в соответствие с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) «Этические принципы медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов», принятой на 18-й Генеральной Ассамблее ВМА, Хельсинки, Финляндия, июнь 1964, с изменениями, внесенными на 64-й Генеральной Ассамблее ВМА, Форталеза, Бразилия, октябрь 2013, Основами Законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан», Приказом МЗ РФ № 266 от 19.07.03 г. «Об утверждении правил клинической практики в Российской Федерации», Национальным стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика», 2005 г. Диагностика цервикальных интраэпителиальных неоплазий проводилась в соответствии МКБ-Х (1995).

Формирование групп пациентов при проведении гистологической оценки биоптатов осуществлялось с соблюдением принципов рандомизации. В исследуемой выборке пациентки с CIN I составили 39 человек, с CIN II – 24, с CIN III – 12 человек. Группу сравнения составляли 30 пациенток без CIN, но с доказанной ВПЧ-инфекцией методом полимеразной цепной реакции, для проведения которой использовали реагенты «АмплиСенс» («Интерлабсервис», Москва, Россия). Первоначально проводили качественный анализ с использованием набора реагентов «АмплиСенс», затем количественный – при помощи набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (Метод детекции: FRT; генотипы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 (суммарно) и генотипов 16, 18 и 45 – с дифференциацией), а также набора реагентов «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-титр-FL» (Метод детекции: FRT; генотипы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68).

Группы пациенток были сопоставимы по возрасту. Анализ клинико-анамнестического материала проводился по историям болезни пациенток и при проведении их клинического обследования. Кольпоскопии предшествовало проведение ПАП-теста и обследование пациенток на ВПЧ, а также цитологическое исследование. При этом для разделения пациенток на группы использовали гистологическую классификацию CIN. Биопсию проводили в условиях асептики и антисептики амбулаторно (на гинекологическом приеме). Иммуногистохимические исследования выполнены по стандартным протоколам с использованием реагентов Diagnostic BioSystems (USA). Для объективизации полученных данных вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК), характеризуя динамику изменения интенсивности иммуногистохимического окрашивания в исследуемых группах. Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации Ki-67 (ИП) проводились полуколичественным методом. Учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при учете 500–1000 клеток) [6]. При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная [7]. Уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% клеток имели позитивную реакцию, умеренный, если 15–30% ядер были позитивны на Ki-67, и высокий – при позитивной реакции более 30% клеток.

Результаты исследований подвергали статистической обработке с применением программного пакета Biostat и приложения Microsoft Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007. При проведении статистической обработки результатов вычисляли выборочные средние, ошибку среднего и стандартное отклонение. Сравнение между собой двух выборок проводили при помощи критерия Стьюдента.

Результаты исследования и обсуждение

Женщины в изучаемой выборке были инфицированы следующими типами ВПЧ: 6, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 56. Наиболее часто выявлялось инфицирование ВПЧ 16-го типа – 16 пациенток, что составило 44,44%, и инфицирование ВПЧ 51-го типа (8 человек – 22,22%). При проведении кольпоскопии просвет шейки матки имел вид узкого канала светло-красного цвета с древовидными сосудами стромы и прозрачными эпителиальными слоями. Отмечали наличие зон гиперемии, лейкоплакии, патологических сосудов, потерявших свою гибкость и древовидность, сосочковые образования, представляющие собой возвышения эпителия. При проведении пробы с уксусной кислотой у всех наблюдаемых пациенток мы наблюдали появление ацидофилии эпителия. Визуальные изображения пунктации и мозаики, образованные соединительнотканно-сосудистыми возвышениями и соответствующие клеточной интраэпителиальной пролиферации, встречались у 76 пациенток (72,38%). Ободки вокруг устьев выводных протоков желез встречались у 100% больных. При проведении пробы с раствором Люголя наличие йод-негативных зон было выявлено у 100% женщин; наличие неоднородных зон йода, косвенно свидетельствующее об инфицировании ВПЧ, также выявлено у 100% больных. У 68,57% пациенток всей анализируемой выборки отмечались проявления цервицита в виде отека и гиперемии слизистой оболочки, полнокровия ее сосудов, наличия выделений слизисто-гнойного характера. Но, как известно, аналогичные кольпоскопические изображения могут иметь место при различных патофизиологических процессах, в связи с чем следующим этапом нашей работы явилось проведение гистологического исследования.

В соответствие с МКБ-10, рубрикой N87, различали: N87.0 Слабовыраженную дисплазию шейки матки (CIN I); N87.1 Умеренную дисплазию шейки матки (CIN II); N87.2 Резко выраженную дисплазию шейки матки (CIN III). Легкую дисплазию определяли при наличии гиперплазии клеток базального и парабазального слоев многослойного плоского эпителия (МПЭ), клеточного и ядерного полиморфизма, повышения митотической активности в них [8]. Среднюю степень дисплазии устанавливали при наличия поражения 1/2-1/3 толщи МПЭ; наличии клеточного полиморфизма (вытянутые, овальные, тесно прилегающие друг к другу клетки, визуализация митозов, в том числе и патологических); незначительного ядерно-цитоплазматического сдвига (ядра крупные, грубая структура хроматина, в ядрах определяются небольшие ядрышки). При выраженной дисплазии эпителия шейки матки гиперплазированные клетки базального и парабазального слоев обнаруживали по всей толщине эпителиального пласта; ядра визуально крупные, овальные или вытянутые, гиперхромные, с митозами, выраженным ядерным полиморфизмом, выраженным ядерно-цитоплазматическим сдвигом, двуядерные клетки. Вместе с тем, клетки сохраняли четкие границы, и их можно дифференцировать на принадлежность к тому или иному слою МПЭ.

В группе сравнения (отсутствие CIN на фоне имеющейся ВПЧ-инфекции) строение эпителиального пласта типичное без признаков дисплазии, но часто – с гипер- и паракератозом. Под слоями МПЭ визуализируется собственная пластинка слизистой оболочки, представленная слоем оформленной соединительной ткани, в которой видны кровеносные сосуды. В группе пациенток с CIN I отмечалась дисплазия базальных слоев плоского эпителия – не более одной трети (нижней) эпителиального пласта. Клетки верхних двух третей остаются зрелыми, хотя в них и обнаруживаются дистрофические изменения. В группе с CIN II мы находили более выраженные диспластические изменения МПЭ эктоцервикса, выражающиеся в гиперхромии ядер, их неправильной форме, нарушении стратификации эпителиального пласта и созревания эпителиальных клеток – появление клеток, подобным базальным, в вышележащих слоях эктоцервикса. Патологически измененные клетки занимали у пациенток этой группы до двух третей эпителиального пласта. В группе пациенток с CIN III диспластические изменения плоского эпителия занимали в более двух третей эпителиального пласта; дифференциация слоев практически не прослеживается. Параллельно отмечалось нарастание выраженности атипии – повышение ядерно-цитоплазматического отношения, гиперхроматоз и полиморфизм ядер с неравномерным распределением хроматина.

Анализируя экспрессию TGFβs, мы наблюдали ее в клетках базального слоя эктоцервикса у пациенток группы сравнения (рис. 1) в 60% случаев, базального и парабазального – в 30%, базального, парабазального и промежуточного – в 10% случаев; у всех пациенток – отсутствие экспрессии в однослойном столбчатом эпителии в зоне трансформации.

В группе с CIN I экспрессия TGFβs определялась в клетках базального слоя у 48,72% пациенток, базального и парабазального – у 30,77% пациенток данной группы, базального, парабазального и промежуточного – у 12,82% (рис. 2); у 7,6% больных экспрессия этого маркера выявлена не была. Также выявлено отсутствие экспрессии TGFβs в призматическом эпителии в зоне трансформации и наботовых желез в собственной пластинке слизистой оболочки шейки матки.

В группе с CIN II экспрессия TGFβs определялась в базальном и парабазальном слоях эктоцервикса – у 20,83% пациенток или только в базальном слое – у 50% женщин этой группы, у части пациенток (29,17%) не определялась. Также экспрессия этого маркера отсутствовала в призматическом эпителии зоны трансформации и наботовых желез.

В группе с CIN III у большинства пациенток (83,33%) экспрессия TGFβs отсутствовала – как в плоском эпителии эктоцервикса (рис. 3), так и в призматическом эпителии наботовых желез и в зоне трансформации.

При проведении количественной оценки экспрессии TGFβs (определение СЦК) в эпителии шейки матки у наблюдаемых пациенток установлено, что в базальном, парабазальном и промежуточном слоях экстоцервикса экспрессия TGFβs статистически значимо более выражена в группах ВПЧ-инфекция без CIN, с CIN I, с CIN II, чем в группе с CIN III (таблица).

В группе сравнения (отсутствие CIN на фоне имеющейся ВПЧ-инфекции) экспрессия Ki-67 определялась исключительно в базальном и парабазальном слоях, ИП=15,23±2,57%. В группе с CIN I экспрессия Ki-67 также определялась исключительно в базальном и парабазальном слоях, ИП=21,44±2,69%. В группе с CIN II экспрессия Ki-67 определялась в базальном и парабазальном слоях, ИП=49,12±3,52%, а также в промежуточном слое, ИП=33,64±4,93%. В группе с CIN III экспрессия Ki-67 определялась в базальном, парабазальном и поверхностном слоях, ИП=63,28±4,31%.

В современных литературных источниках приводятся разноречивые данные, касающиеся уровня экспрессии белков семейства TGFβ в эпителии эктоцервикса у пациенток с CIN и ВПЧ. Так, одни авторы отмечают увеличение уровня TGFβ в цервикальной слизи при дисплазии шейки матки и цервикальном раке [9]. Другие исследования также указывают на нарастание интенсивности экспрессии и увеличение слоев эпителия, экспрессирующих TGFβ в ряду CIN I – CIN III, но, тем не менее, уменьшение экспрессии при переходе в cancer in situ [10]. С другой стороны, на сегодняшний день также известно, что в процессе прогрессирования карциномы шейки матки экспрессия белков семейства TGFβ уменьшается [4]. Кроме того, при этом прогрессия CIN в цервикальную карциному сопровождается снижением восприимчивости трансформированных клеток к антипролиферативному действию цитокинов этого семейства [11].

TGFβ является мощным ингибитором роста эпителиальных клеток; тип 16 ВПЧ оказывает существенное влияние на рост и дифференцировку эпителия эктоцервикса. В этих условиях TGFβ1 участвует в ремоделировании эпителия в качестве важного паракринного/аутокринного фактора, действие которого направлено на ограничение распространения ВПЧ-инфекции путем стимуляции апоптоза [12] и ингибирования пролиферации эпителиальных клеток, инфицированных ВПЧ [10]. Кроме того, известно, что все три изоформы TGFβ способствуют индукции синтеза провоспалительных цитокинов в эпителиальных клетках шейки матки [5].

Заключение

Таким образом, учитывая полученные результаты, можно утверждать, что экспрессии TGFβs в эпителии эктоцервикса по мере прогрессирования CIN уменьшается, вплоть до полного исчезновения, что, по-видимому, свидетельствует о снижении антипролиферативной активности эпителия посредством аутокринной регуляции.

Supplementary Materials

  1. Table. Average cytochemical factor (CBFV) in immunohistochemical staining for TGFβs in the epithelium of the ectocervix in patients with HPV infection, M±m
  2. Figure 1. The TGFβs expression in basal cells of cervix in women of comparison group, x 150
  3. Figure 2. The TGFβs expression in cells of basal, parabasal and intermediate layers of cervix in women with CIN I, x 150
  4. Figure 3. The absence of TGFβs expression in cervix epithelium of women with CIN III, x 600

References

1. Babyishkina N.N., Malinovskaya E.A., Staheeva M.N., Volkomorov V.V., Ufandeev A.A., Slonimskaya E.M. Role of transforming growth factor TGF-β1 in the pathogenesis of breast cancer. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal. 2010; 6: 63-70. (in Russian)

2. Annes J., Munger J., Rifkin D. Making sense of latent TGF-beta activation. J. Cell Sci. 2003; 116(2): 217-24.

3. Hellawell G.O., Brewster S.F. Growth factors and their receptors in prostate cancer. BJU Int. 2002; 89(3): 230-40.

4. Chung J.K., Lee S.K., Kim M.K., Bae D.H., Kim C.J. An Immunohistochemical study on the expression of EGFR, TGF-alpha and Ki-67 in the uterine cervical neoplasia. Korean J. Obstet. Gynecol. 2001; 44(4): 727-33.

5. Sharkey D.J., Tremellen K.P., Jasper M.J., Gemzell-Danielsson K., Robertson S.A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. J. Immunol. 2012; 188(5): 2445-54.

6. Korsakova N.A. Assessment of the degree of malignancy of epithelial tumors of the colon-based immunophenotype of tumor cells. Diss. Moscow; 2007. 23c. (in Russian)

7. Raskin G.A. HER2 oncogene in breast cancer: mechanism of influence on tumor behavior (comparative quantitative immunohistochemistry). Diss. Kazan; 2007. 24c. (in Russian)

8. Prilepskaya V.N., Kondrikov N.I., Bebneva T.N. The value of human papillomavirus in cervical dysplastic development processes. Consilium Medicum: Ginekologiya. 2000; 2(3): 56-62. (in Russian)

9. Belokrinitskaya T.E., Vitkovskiy Yu.A., Ponomareva Yu.N., Mochalova M.N., Lomneva G.M. A tumor necrosis factor and transforming growth factor b in the regulation of apoptosis and proliferation of cells in dysplasia and cervical cancer. Tsitokinyi i vospalenie. 2006; 5(1): 31-3. (in Russian)

10. El-Sherif A.M., Seth R., Tighe P.J., Jenkins D. Decreased synthesis and expression of TGF-beta1, beta2, and beta3 in epithelium of HPV 16-positive cervical precancer: a study by microdissection, quantitative RT-PCR, and immunocytochemistry. J. Pathol. 2000; 192(4): 494-501.

11. Rogovskaya S.I. Genital HPV infection: the role of interferons in the pathogenesis and treatment (review). Gynekologiya. 2003; 5 (5): 195-8. (in Russian)

12. Rorke E.A., Jacobberger J.W. Transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta1) enhances apoptosis in human papillomavirus type 16-immortalized human ectocervical epithelial cells. Exp. Cell Res. 1995; 216(1): 65-72.

Received 10.03.2016

Accepted 25.03.2016

About the Authors

Samodelkin Yevgeny I., MD, Professor of Pathological Physiology, Academician E.A. Wagner Perm State Medical University, Ministry of Health of Russia. 614990, Russia, Perm, Petropavlovskaya str. 26. Tel.: +73422171031; +79128884057. E-mail: sei-p@mail.ru
Kosareva Polina V., MD, main researcher of Department of morphological and pathophysiological studies CSRL, Head of the course of clinical laboratory diagnostics, an assistant professor of microbiology, virology with the course of clinical laboratory diagnostics, Academician E.A. Wagner Perm State Medical University, Ministry of Health of Russia. 614990, Russia, Perm, Petropavlovskaya str. 26. Tel.: +73422171031; +79824623114. E-mail: perm-bagira@narod.ru
Vetelina Valentina V., post-graduate student of the Department of Pathological Physiology, Academician E.A. Wagner Perm State Medical University, Ministry of Health of Russia. 614990, Russia, Perm, Petropavlovskaya str. 26. Tel.: +73422171031; +79082425879

For citations: Samodelkin E.I., Kosareva P.V., Vetelina V.V. Transforming growth factor-β expression in the ectocervical epithelial cells in cervical intraepithelial neoplasia and HPV infection. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2016; (6): (in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.6.

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.