Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации НШ-1694.2014.7.
Проблема привычного выкидыша в настоящее время приобретает особую актуальность в связи с реализацией репродуктивной функции женщинами в более позднем возрасте, когда каждая беременность является желанной, а иногда и единственно возможной в данной супружеской паре.
Нормальное осуществление репродуктивной функции у женщин возможно благодаря гармоничному функционированию иммунологических механизмов. При физиологическом течении беременности плод является своеобразным иммунологически привилегированным объектом, поскольку, обладая антигенным набором, унаследованным от отца и являясь полуаллогенным, он, тем не менее, не отторгается материнским организмом [1–4]. Взаимоотношения между эмбрионом и материнским организмом начинаются еще до имплантации, поскольку уже на предшествующих ей стадиях эмбрион экспрессирует свой геном [5]. На этом этапе включаются нейрогуморальные механизмы подготовки материнского организма к беременности. Значимость иммунных механизмов в этом процессе проявляется при его нарушениях и выражается в ранних самопроизвольных потерях беременности.
Диагноз «привычный выкидыш», согласно определению ВОЗ, устанавливается в случае произошедших подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности на сроке гестации до 22 недель (код N96 по МКБ-10). Среди причин, приводящих к такому осложнению, могут быть генетические, анатомические, эндокринные, инфекционно-воспалительные, тромбофилические, аутоиммунные нарушения. По данным различных авторов, в 5–20% случаев причины прерываний не могут быть установлены современными диагностическими ресурсами, поэтому диагноз формулируется как привычный выкидыш неясной этиологии (идиопатический привычный выкидыш) [5].
Считается, что по иммунологическим признакам реализации выкидыш неясной этиологии аналогичен реакциям острого отторжения чужеродного трансплантата (аллоиммунным реакциям адаптивного иммунитета), и, следовательно, его причины связаны с нарушениями процессов восприятия иммунной системой сигналов, исходящих от развивающегося плода, то есть с аллоиммунными причинами [5, 6]. Поэтому выявление аллоиммунных причин выкидыша рассматривается как необходимая предпосылка для обоснования патогенетической иммунотерапии. Этим обусловлена и актуальность исследований по поиску маркеров иммунологических нарушений при привычном выкидыше неясной этиологии.
Отмеченное сходство в реакциях острого отторжения аллогенного трансплантата и выкидыше определило на долгие годы направления исследований в иммунологии репродукции. В первую очередь анализировали те маркеры, значимость которых для развития реакций адаптивного иммунитета и судьбы трансплантата была подтверждена в экспериментальных модельных исследованиях [7, 8]. Однако неоднозначность и даже противоречивость результатов исследований тех же маркеров в клинической практике является темой обсуждений широкого круга публикаций последнего десятилетия [5, 6, 9, 10].
Для аллоиммунных реакций отторжения характерно появление растворимых факторов, характеризующих провоспалительную направленность дифференцировки эффекторных клеток, антител, способствующих лизису чужеродных клеток-мишеней, цитотоксических клеток, непосредственно осуществляющих лизис клеток-мишеней, а также усиление функциональной активности естественных киллерных клеток [11]. Поэтому основные направления поиска иммунологических критериев прогноза развития беременности на ранних ее этапах прежде всего связывают с оценкой клеточных субпопуляций периферической крови и продукции активированными клетками биологически активных молекул.
Так, исследованиями последних лет продемонстрирована значительная гетерогенность субпопуляций Т-хелперных клеток (CD4+-клеток, Th-клеток), от соотношения которых зависит направленность реакций адаптивного иммунитета [11–13]. Наиболее значимы четыре линии дифференцировки CD4+-клеток, различающиеся цитокиновой продукцией и биологической функцией: Th1 (продуцирующие цитокины интерлейкин (ИЛ)-2, интерферон (ИФН)-γ, фактор некроза опухоли (ФНО)-α, β, Th2 (продуцирующие цитокины ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13), Th17 (продуцирующие цитокины семейства ИЛ-17, которые опосредуют развитие острого воспаления аутоиммунного и аллергического характера) и естественные Т-регуляторные клетки с поверхностным фенотипом CD4+CD25+ и конститутивной экспрессией транскрипционного фактора Foxp3 (forkhead box p3) (Трег). Значимость различных субпопуляций CD4+-клеток для репродуктивного процесса постоянно уточняется.
В ранних исследованиях обсуждалась необходимость превалирования во время гестации Th2-типа иммунного ответа, а преобладание в крови цитокинов Th1-типа трактовалось как угроза беременности, прерывание беременности в первом триместре ассоциировалось с нарушением цитокинового баланса Th1/Th2 [14].
В настоящее время признано, что важнейшие механизмы имплантации, плацентации, а также подготовки материнского организма к родам протекают на фоне провоспалительных реакций [15]. Это позволило предположить, что направленность Th1/Th2-реакций зависит от срока гестации – на самых ранних стадиях беременности преобладают воспалительные реакции, а сдвиг в сторону Th2-направленности наблюдается на более поздних сроках [16].
Кроме того, в ранних исследованиях аргументом в пользу необходимости превалирования во время беременности иммунного реагирования Th2-типа служило утверждение о развитии состояния гестационной иммуносупрессии [17]. С этой точки зрения смысл иммунокоррекции ранних выкидышей видели в увеличении состояния супрессии материнской иммунной системы. Однако наличие состояния гестационной иммуносупрессии не могло объяснить, каким образом во время беременности мать, вынашивая ребенка, одновременно остается способной защитить себя и плод от инфекций. Последнее время все большее подтверждение находит представление об активном обоюдном участии материнской иммунной системы и плода в обеспечении развития беременности. Инвазивный трофобласт индуцирует такие изменения в дифференцировке иммунокомпетентных клеток, которые способствуют поддержанию гестационных процессов на фоне формирования толерантности к аллоантигенам плода. При этом сохраняется способность материнского организма развивать иммунный ответ на поступающие извне антигены [18, 19].
В связи с вышеизложенным в качестве основы иммунорегуляции беременности рассматривают уже не парадигму Th1/Th2-ответа, а парадигму Th1/Th2/Th17/Treg-клеток [20]. Согласно последней, в результате индуцированной беременностью дифференцировки иммунокомпетентных клеток должны появляться материнские регуляторные клетки Трег, которые распознают отцовские антигены плода, супрессируют материнские эффекторные Т-клетки и смягчают материнско-фетальный аллоиммунный конфликт, вызванный отцовскими антигенами [21]. Считается, что регуляция цитокиновой продукции Трег-клетками во время беременности более значима, чем баланс Th1/Th2 [7]. При этом коррекцию нарушений рассматривают уже не с позиций увеличения супрессии материнской иммунной системы в целом, а с позиций стимуляции специфичных регуляторных механизмов подавления иммунного ответа на конкретные антигены – аллоантигены плода [22].
Модельные эксперименты на лабораторных животных однозначно подтверждают влияние Трег на репродуктивную функцию, поскольку только Трег, выделенные из крови беременных самок, обеспечивают защиту плода и нормальный исход беременности, а дефицит Трег-клеток ассоциирован с нарушением имплантации и спонтанными абортами [4, 23]. При этом показано увеличение в периферической крови и децидуальной оболочке пациенток с привычным выкидышем клеток с фенотипом Th17 [24]. Также в модельных экспериментах продемонстрирован взаимоисключающий характер дифференцировки в направлении Th17-клеток и Трег-клеток [25].
Клинические исследования показали, что во время беременности наблюдается динамика Treg-клеток, заключающаяся в увеличении их доли среди CD4+-клеток периферической крови и децидуальной оболочки матки в течение раннего периода и во втором триместре и уменьшении в послеродовом периоде [26]. Дефицит Трег-клеток ассоциирован с привычным выкидышем [23]. Подтверждение или опровержение этих наблюдений наталкиваются на методические трудности, связанные с доказательством корреляции определяемого фенотипа циркулирующих Т-регуляторных клеток и реализацией ими супрессивной функции [21]. Тем не менее, очевидно, что развитие осложнений беременности является следствием неадекватности формирующегося субпопуляционного состава Тh-клеток потребностям гестационного процесса [19].
Формирование несоответствующего субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток может определяться нарушениями в процессах распознавания материнской иммунной системой аллоантигенов плода, что, в свою очередь, должно найти отражение в характере гуморальных реакций на аллоантигены плода. К тому же в настоящее время обсуждается концепция, рассматривающая иммунологические процессы при беременности не с точки зрения формирования толерантности к аллоантигенам плода, а с точки зрения блокирования функций цитотоксических лимфоцитов и преимущественного развития аллоантительного ответа [27].
Одной из наиболее изученных гуморальных аллогенных реакций во время беременности является образование антиотцовских антилейкоцитарных антител (АОАТ). Трофобласт на своей поверхности экспрессирует только неклассические антигены HLA I класса системы гистосовместимости: HLA-E, HLA-G и HLA-F с невыраженным полиморфизмом и не участвующие в процессах презентации антигенов. Особенность неклассических HLA-антигенов в том, что их молекулы распознаются ингибиторными рецепторами (KIR-рецепторами) естественных киллерных клеток (NK-клеток, γδT-клеток) децидуальной оболочки матки. В результате блокируется цитолитическая активность этих клеток, что способствует развитию плода [28]. Экспрессия классических антигенов HLA-А и HLA-В на трофобласте блокирована, экспрессия антигенов HLA II класса отсутствует.
Однако признаки стимуляции материнской иммунной системы отцовскими антигенами даже при нормальном течении беременности все-таки присутствуют. Так, было установлено, что АОАТ определяют у многорожавших женщин [29]. У женщин с физиологическим течением беременности в целом регистрируется низкий уровень антител, но они могут быть обнаружены начиная с 28-й недели гестации [30]. Есть данные, что в 1-м триместре беременности антитела зарегистрированы у 5% женщин с нормально протекающей беременностью и у 10% женщин с привычным выкидышем [31].
Мнения о роли АОАТ в развитии привычного выкидыша противоречивы. Есть данные как о высоком уровне анти-НLA-антител у женщин с привычным выкидышем, так и об отсутствии связи АОАТ с ранними потерями беременности [32, 33].
Ряд исследователей связывают низкий уровень антилейкоцитарных антител с ранними потерями беременности [34]. В пользу такого положения привлекаются данные о совпадениях антигенов главного комплекса гистосовместимости – HLA – у партнеров в супружеских парах с привычным выкидышем. Следствием является недостаточная аллогенная стимуляция материнской иммунной системы и низкий гуморальный ответ, который не способствует успешному развитию беременности [35].
Однозначного подтверждения эта точка зрения не получила [36]. Поэтому до сих пор не ясно, являются ли антиотцовские антитела фактором, необходимым для нормального протекания беременности, зависит ли продукция антител к антигенам отца НLA I или II класса от совместимости супружеской пары по HLA-антигенам, имеет ли уровень анти-НLA-I и/или анти-НLA-II антител в сыворотке крови беременных диагностическое значение для прогноза выкидыша на раннем сроке.
Одной из возможных причин противоречивых представлений о значимости антиотцовских антител является отсутствие единого метода их определения [37]. Это могут быть и комплемент-зависимые антитела, определяемые в лимфоцитотоксическом тесте [34, 35], и антитела, определяемые в тесте перекрестной цитотоксичности [31].
Есть сообщения, что во время беременности антиотцовские антитела имеют особую структуру и обозначаются как ассиметричные антитела. Показано, что цитокины Th2-функциональной направленности способствуют увеличению пропорции асимметричных антител. Этот факт согласуется с мнением об относительном превалировании Th2-ответа во втором триместре беременности и с данными о выявлении АОАТ при физиологической беременности в начале третьего триместра [16, 30]. Один из Fab-фрагментов асимметричных антител гликозилирован, имеет обогащенный маннозой олигосахаридный остаток [38]. Именно с этим связывают неспособность асимметричных антител активировать эффекторные механизмы (комплемент-зависимую цитотоксичность, фагоцитоз), поэтому их роль во время беременности считается защитной, и они рассматриваются как одна из составляющих блокирующих антител [38, 39].
Блокирующие антитела – антитела, которые опосредуют угнетение ответа обратной связью [2]. Как правило, это растворимые факторы, формирующие супрессивный эффект сыворотки матери на клеточные реакции в эксперименте. Природа блокирующих факторов различна, биологический эффект определяется экспериментальной моделью, в которой он регистрируется. Это могут быть факторы, блокирующие реакцию торможения миграции макрофагов (MIF-блокирующие антитела), факторы, блокирующие реакцию ЕА-розеткообразования при определении антител к рецепторам отцовских В-лимфоцитов (FcR-блокирующие антитела), факторы, блокирующие реакцию в смешанной культуре лимфоцитов партнеров (MLR-блокирующие антитела), факторы, блокирующие выявление антител в реакции комплемент-зависимой цитотоксичности.
Также в роли блокирующих антител могут выступать антиидиотипические антитела, направленные к антиген-связывающему участку цитотоксических антител, распознающих отцовские антигены, или идиотипическим детерминантам Т-клеточного рецептора [2, 40]. Есть сообщения о том, что за блокирующий эффект ответственны антитела класса иммуноглобулина G изотипа G3 [41].
Считается, что блокирующие антитела играют протекторную роль для плода, поскольку способны при воздействии на Т-лимфоциты матери подавлять распознавание антигенов отца, не вызывают патологических изменений в плаценте и у плода, не проникают через плаценту и не циркулируют в крови плода [2, 3].
Исследованию блокирующих антител в смешанной культуре лимфоцитов партнеров в парах с привычным выкидышем в период ранней беременности было посвящено значительное количество работ [42, 43].
Однако вследствие выраженной гетерогенности выборок пациентов для анализа и гетерогенности схем выявления блокирующих антител однозначного вывода о значимости их для реализации раннего выкидыша сделано не было [5, 6, 44].
Тем не менее, интерес к исследованию блокирующих факторов сыворотки беременных поддерживается до настоящего времени [45]. В экспериментальных моделях на линейных мышах показано снижение под влиянием сыворотки беременных самок способности дендритных клеток индуцировать антиген-специфическую пролиферацию и цитокиновую секрецию клетками лимфатических узлов [46].
Полученные результаты указывают на возможность нарушений в распознавании антигенов и, соответственно, нарушений во взаимодействии звеньев врожденного и адаптивного иммунитета, которые могут определять судьбу беременности на ранних стадиях ее развития.
Лимфоидными клетками, осуществляющими функции врожденного иммунитета, являются натуральные киллеры (NК-клетки), осуществляющие спонтанную цитотоксическую активность против аллогенных клеток и продуцирующие цитокины провоспалительного спектра (ИФН-γ и ФНО-α). Есть данные о том, что дендритные клетки могут взаимодействовать с маточными НК-клетками и регулировать их функцию в маточно-плацентарном пространстве [4, 47].
Цитолитическая активность маточных NK-клеток ограничена взаимодействием с неклассическими молекулами HLA-G и HLA-E трофобласта, а также их растворимыми формами [48]. Известно, что маточные NК-клетки важны для инвазии трофобласта и успешного исхода беременности [49]. Показано участие NК-клеток в ремоделировании спиральных артерий беременной матки [50], в регуляции активности Th17-клеток [51]. Отмечается увеличенная экспрессия Toll-like рецептора 3 (одного из рецепторов, регулирующих активацию врожденного иммунитета и обеспечивающих взаимосвязь с адаптивным иммунитетом) на децидуальных NК-клетках женщин с привычным выкидышем, что также может указывать на нарушение процессов распознавания при этой патологии [52].
Участие дендритных и NК-клеток в формировании толерантности к аллоантигенам плода продемонстрирована в работах по изучению экспрессии на поверхности лимфоцитов молекулы CD200. В результате взаимодействия CD200 с рецепторами как дендритных клеток, так и NК-клеток в них индуцируется секреция индоламиндиоксигеназы, и они приобретают способность посредством продукции трансформирующего фактора роста-b стимулировать генерацию Т-регуляторных клеток и, соответственно, индуцировать формирование периферической толерантности [7, 53]. С количеством CD200-позитивных клеток среди аллогенных лимфоцитов, которые вводили женщинам с привычным выкидышем, связывают положительный эффект цитотерапии. Так, в группе женщин, беременность которых закончилась родами, число CD200-позитивных клеток среди введенных лимфоцитов было существенно выше, чем у женщин, беременность которых закончилась выкидышем [54].Интерес к изучению NК-клеток в развитии раннего выкидыша сохраняется до настоящего времени [55].
При этом анализируется функциональная и фенотипическая гетерогенность данной субпопуляции [56].
Предполагается, что в генезе привычного выкидыша большую роль играет нарушение взаимодействий NК-клеток и клеток адаптивного иммунитета. Тем не менее, значимость оценки и маточных NК-клеток, и NК-клеток периферической крови для прогноза привычного выкидыша остается невыясненной [57].
Таким образом, исследования различных аспектов состояния иммунной системы при беременности все еще не дают однозначного ответа на вопросы, какие иммунные механизмы обеспечивают формирование толерантности к антигенам плода отцовского происхождения, а какие приводят к нарушениям гестационных процессов. В то же время наметился сдвиг в сторону исследований регуляторных механизмов, носящих специфический характер и связанных, в частности, с формированием и функционированием естественных регуляторных Т-клеток.
Вышеописанные механизмы открывают новые направления поиска иммунологических критериев прогнозирования исхода беременности при привычном выкидыше, а также обоснования различных способов терапии данного состояния.
