На сегодняшний день одной из наиболее актуальных проблем медицины является эндометриоз. Частота этого заболевания в популяции составляет от 15 до 70% у женщин репродуктивного возраста и до 50 % у обследующихся по поводу бесплодия [3, 21, 24]. Хирургический метод в лечении эндометриоза является первостепенным, но не всегда достаточным: у 20—30% больных с распространенными формами эндометриоза возникает рецидив заболевания [1].
Несмотря на увеличение числа научных и клинических исследований, посвященных разным аспектам эндометриоза, значительное количество вопросов относительно диагностики, частоты, особенностей течения и терапии остаются нерешенными. Недостаточно понятны и механизмы развития болезни. Ни одна из предложенных концепций не может полностью объяснить его патогенез и разнообразие локализаций очагов эндометриоза.
Одной из наиболее распространенных является имплантационная теория, согласно которой происходит ретроградный заброс в брюшную полость клеток эндометрия, отторгнувшихся во время менструации, и их дальнейшая имплантация на окружающих органах и брюшине [19]. Поскольку ретроградный заброс менструальной крови наблюдается у большинства женщин репродуктивного возраста, заболевание развивается лишь в результате сосуществования дефекта клиренса менструальной крови с брюшины малого таза с возможными нарушениями в иммунной системе. В результате повышенной экспрессии цитокинов, фактора роста макрофагов (MDGF),фактора некроза опухоли α (TNF-α), сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР, или VEGF), моноцитарного хемотаксического белка(MCP-1) происходит имплантация и рост эндометриальных клеток [6, 7, 12, 15, 25].
Ангиогенез является физиологическим процессом, вовлеченным в эмбриональное развитие, заживление раны, лежит в основе всех процессов репродуктивного цикла женщины. Уникальность эндометрия заключается в способности к стремительному циклическому росту, секреции, регрессу и регенерации в течение каждого менструального цикла [17]. Процесс ангиогенеза, как правило, подавляется в нормальных тканях взрослого организма, за исключением онкологической патологии и таких заболеваний, как псориаз, ретинопатия и эндометриоз [5, 22]. Ангиогенез представляет собой многоэтапныйкомплекс с участием различных проангиогенных факторов роста, таких как СЭФР, или VEGF, основной фактор роста фибробластов (BFGF), а такжеингибитора ангиогенеза тромбоспондина-1 (TSP-1) и т.д. Это так называемый чистый баланс факторов, определяющий финал ангиогенного фенотипа патологических феноменов, таких как опухоли и эндометриальные повреждения [10, 11, 24].
Давно известно, что эндометриоз вызывает местное воспаление, нарушения в фибринолитической системе, а именно снижение тканевого активатора плазминогена (TPA), повышение ингибитора активатора плазминогена (PAI), в результате чего происходит образование плотных фибриновых нитей, являющихся ключевым фактором в развитии спаечного процесса [2, 6].
Сегодня в мире широкое применение нашла группа препаратов, ингибиторов 3-гидрокси3-метилглутарил-коэнзим А (HMG-CoA) редуктазы — статины. Общеизвестно, что данные препараты снижают синтез холестерина, эффективны при первичной и вторичной профилактике атеросклероза и коронарного синдрома. Недавние исследования наглядно демонстрируют антиангиогенный и противовоспалительный эффект этих препаратов [2, 4, 13, 14, 16, 20].
Цель настоящего исследования — изучение влияния статинов на очаги эндометриоза в эксперименте.
Материал и методы исследования
Экспериментальный эндометриоз индуцировали у крыс-самок линии Вистар (разводки питомника «Столбовая») массой 160—180 г, находящихсяв фазе проэструса. Животные содержались в виварии в условиях регулируемого светового дня (12×12 ч) и постоянной комнатной температуры (23±2°С), на стандартном пищевом рационе и при свободном доступе к воде. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principlesfor Biomedical Research Involving Animals» (1990 г.).
Техника оперативного вмешательства
Оперативные вмешательства проводили на иммобилизационном станке под золетиловым (производство Virbac Sante Animal, Франция) наркозом в течение 35—40 мин. Препарат вводили в дозе 5 мг на 1 кг массы тела. Для премедикации за 15 мин до инъекции золетила использовался препарат Ксила (Interchemie, Нидерланды). Препарат вводили в дозе 0,1 мл на 1 кг массы тела. Крысе-самке в асептических условиях, под наркозом, после предварительной химической депиляции кожи с использованием крема «Veet» производили нижнюю срединную лапаротомию для обнаружения органов репродуктивной системы.
I этап эксперимента
Моделирование эндометриоза осуществлялось по ранее описанной методике [23]. Производили лигирование левого маточного рога на протяжении 5 мм. После удаления окружающей жировой ткани сегмент левого маточного рога помещали в теплый изотонический раствор. Фрагмент маточного рога (миометрий с эндометрием) размером 3×3 мм пришивали к брюшине на передней брюшной стенке с помощью викриловой нити 5/0 на атравматичной колющей игле. Брюшину, мышцы, апоневроз ушивали непрерывными викриловыми швами. На кожу накладывали отдельные этибондовые швы. После I этапа операции животные находились под наблюдением в течение 5 нед для приживления имплантов без какого-либо медикаментозного лечения.
II этап эксперимента
Целью второй лапаротомии были выявление полученных эндометриальных имплантов, измерение их размеров, биопсия с последующей гистологической и иммуногистохимической оценкой материала. В последующие 3 дня после операции животным предоставлялся физический покой, после чего животные рандомизированно были разделены на 3 группы. Животные 1-й группы (низкие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали 0,5 мг/кг оральногоаторвастатина (препарат липримар производства Пфайзер Интернешнл, Германия). Животные2-й группы (высокие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали 2,5 мг/кг орального аторвастатина. Животные 3-й группы (контрольная группа, 7 крыс) не получали никакого лечения. Медикаментозное лечение осуществлялось посредством орогастрального зонда и продолжалось в течение 21 дня согласно ранее описанной методике [14].
III этап эксперимента
После завершения медикаментозного лечения под золетиловым наркозом выполняли третью лапаротомию и затем животных подвергали эвтаназии. Измеряли размеры имплантов, после чего импланты иссекали в пределах окружающей ткани и фиксировали материал в 10% нейтральном растворе формалина для последующей гистологической и иммуногистохимической оценки с применением морфометрического анализа.
Гистологический метод. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина и по общепринятой методике заливали в парафиновые блоки. Гистологические срезы толщиной 4—5 мкм, полученные на микротоме «Leica» (Германия), окрашивали гематоксилиноми эозином.
Иммуноморфологический метод. Для иммуноморфологического исследования использовали непрямой иммунопероксидазный метод с применением первичных (специфических) моноклональных антител: к СЭФР, клон G153-694 производства Lab Vision (США).
Гистологические срезы толщиной 4—5 мкм, изготовленные из парафиновых блоков с помощью микротома «Leica» (Германия), помещалина покрытые специальным адгезивом (APES-ацетон) предметные стекла. Эндогенную пероксидазу в депарафинированных срезах блокировали 3% перекисью водорода. Демаскировку антигенов производили по стандартной схеме в микроволновой печи в течение 20 мин при 600 В в 0,1 М растворе цитратного буфера (рH 6,0). После инкубациигистологических срезов с первичными антителами (рабочее разведение антисывороток 1:50—100, время инкубации 45—60 мин при температуре 37ºС) их обрабатывали вторичными биотилированными антикроличьими иммуноглобулинами.
Для последующей визуализации результата реакции связывания антигена с антителом использовали систему детекции «Ultra Vision LP Value HRP Polymer» (Lab Vision, США). Применяли фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и специального реактива (3,3-диаминобензидин).
Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы в участках локализации антигена. Для СЭФР — цитоплазма и клеточные мембраны клеток, в определенной мере — экстрацеллюлярный матрикс (депо факторов роста).
Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных, специфических антител (путем их замены неиммунным реактивом — бычьей сывороткой). Положительный контроль осуществлялся использованием гистологических препаратов эндометрия в фазу пролиферации.
После проведения иммунопероксидазной реакции гистологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микроскоп DM-LB («Leica», Германия).
Морфометрический метод. Результаты иммуногистохимической реакции оценивали с помощью полуколичественного морфометрического метода [9]. Вычисляли коэффициент экспрессии СЭФР по общепринятой схеме. Визуально оценивали интенсивность окраски клеток в баллах от 0 до 3 (отрицательная, слабая, умеренная и выраженная), подсчитывали процент позитивно окрашенных клеток при каждом значении интенсивности окраски (минимум для 500 эпителиальных и 500стромальных клеток эндометрия в 10 полях зрения при увеличении микроскопа ×400).
Коэффициент экспрессии рассчитывали для каждого наблюдения по формуле, где б — интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П — процент окрашенных клеток (от 0 до 100) при каждом значении б.
Статистическую обработку экспериментального материала проводили с помощью статистических программ Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corp., США) и Statistica 6.0 for Windows (StatSoftInc., США) с соблюдением общих рекомендаций для медицинских и биологических исследований.
Результаты исследования и обсуждение
Основные исследуемые параметры и полученные результаты приведены в таблице. К началу эксперимента масса тела животных колебалась от 160,4±2,96 до 170,3±5,17 г. К моменту окончания эксперимента отмечалось незначительное, статистически незначимое снижение массы тела животных. Размеры имплантов при второй операции были сопоставимы в 3 исследуемых группах и составляли 13,5±0,83; 16,1±0,49 и 14,4±0,58 мм² соответственно. После лечения (при третьей операции) в 1-й и 3-й группах отмечалось незначительное увеличение размеров имплантов — с 13,5±0,83 до 14,3±0,74 мм² и с 14,4±0,58 до 15,1±0,29 мм² соответственно (р>0,05), тогда как во 2-й группе выявлено резкое (более чем в 4 раза)уменьшение размеров имплантов – с 16,1±0,49 до 4,0±0,29 мм² (p<0,05). Визуальная характеристика имплантированных очагов эндометриоза в трех исследуемых группах при последней операции представлена на рис. 1 (см. на вклейке).
Экспрессия СЭФР в эпителии обычно кистозно-расширенных желез (ЭКРЖ) до лечения колебалась в пределах от 2,20±0,13 до 2,25±0,08. После лечения в 1-й и 3-й группах отмечалось некоторое увеличение экспрессии СЭФР в ЭКРЖ — с 2,21±0,05 до 2,53±0,1 и с 2,20±0,13 до 2,52±0,07 соответственно (p>0,05), тогда как во 2-й группе имело место статистически незначимое уменьшение экспрессии СЭФР в ЭКРЖ — с 2,25±0,08 до 2,0±0,12 (p>0,05).
Экспрессия СЭФР в строме до лечения колебалась в пределах от 1,70±0,9 до 1,72±0,03. После лечения в 1-й и 3-й группах отмечалось увеличение экспрессии СЭФР в строме с 1,70±0,9 до 1,9±0,1 и с 1,72±0,03 до 1,93±0,02 соответственно (p>0,05), тогда как во 2-й группе отмечалось статистически значимое уменьшение экспрессии СЭФР в строме более чем в 3 раза ‒ с 1,71±0,05 до 0,54±0,03 (p<0,05).
Гистологическая и иммуноморфологическая характеристика экспериментальных очагов эндометриоза представлена на рис. 2—4 (см. на вклейке). Обращает на себя внимание тот факт, что только в группе животных, получавших высокие дозы статинов, удалось вызвать склероз и атрофию очага эндометриоза (см. рис.3 на вклейке).
Недавние исследования наглядно демонстрируют ингибирующее действие статинов на процессы ангиогенеза наряду с их способностью снижать уровень липопротеидов [18]. Действие статинов на ангиогенездозозависимое и бифазное: в низких дозах они дают проангиогенный эффект путем активации серин/треонинпротеинкиназы B (akt), увеличивая продукцию оксида азота, тогда как в высоких дозах ингибируют систему белковой изопрениляции, включая такие субстраты, как геранил-геранилпирофосфат, фарнезилпирофосфат, играющие ключевую роль при пролиферации клеток, апоптозе и экспрессии генов [8, 20].
В 2006 г. появилась первая публикация о влиянии статинов на очаги эндометриоза. Группой ученых из Йельского университета (Нью-Хейвен, Коннектикут, США) и Польской академии центра научных исследований (Варшава) во главе с Петром Петровским продемонстрирован ингибирующий эффект мевастатина и симвастатина на клеточную пролиферацию при эндометриозе на модели invitro [16].
Через год появились данные об эффективности ловастатина при эндометриозе на модели in vitro [13]. Канадские ученые уточнили, что в присутствии низких доз ловастатина происходит только ингибирование ангиогенеза, тогда как под воздействием высоких доз ловастатина имеет место ингибирование ангиогенеза и клеточной пролиферации.
Следующим прорывом научных исследований, подтверждающим ингибирующее действие статинов в очагах эндометриоза, являются экспериментальные данные ученых университетской больницы баскент (Анкара, Турция) во главе с M. Oktem[14].
В 2009 г. появились данные о роли симвастатина в предотвращении развития эндометриоза на модели экспериментальных мышей, полученные исследователями Научно-исследовательского центра репродуктивного здоровья женщин и Вандербильтского университета (Нэшвилл, Теннесси, США) во главе с К.L. Bruner-Tran. В исследовании также приводятся убедительные данные об ингибирующем действии высоких доз статинов в очагах эндометриоза, снижении объема имплантов на 98% [4].
Наши экспериментальные данные показывают уменьшение размеров эндометриоидныхимплантов практически в 4 раза, снижение экспрессии СЭФР в стромальном компоненте более чем в 3 раза по сравнению с контрольной группой. По сути, результаты нашего исследования доказывают ингибирующее влияние статинов на очаг эндометриоза при условии соблюдения режима дозирования. Однако приемлемо ли использование достаточных доз статинов в клинической практике?
Сегодня аторвастатин выпускается в суточной дозировке 10, 20, 40, 80 мг. Как видно, 80 мг — это максимально допустимая суточная доза препарата. В недавнем проспективномрандомизированном исследовании, включающем более 10 000 больных, было показано, что терапия аторвастатином в дозе 80 мг в день с целью интенсивного снижения уровня липидов у больных со стойким коронарным синдромом оказывает более значимый клинический эффект, чем лечение в дозе 10 мг в день. Однако лечение высокими дозами статинов (80 мг в день) вызывает несколько большее увеличение аминотрасфераз по сравнению с низкими дозами (10 мг в день) (1,2 против 0,2%соответственно). Несмотря на это, повышение уровня аминотрансфераз при лечении высокими дозами аторвастатина носит преходящий характер и не приводит к заболеваниям печени [10]. По-видимому, представленный положительный опыт клинического применения высоких доз статинов может быть учтен и при лечении больных эндометриозом.
Таким образом, представленные результаты демонстрируют высокую эффективность статинов, что свидетельствует о необходимости продолжения экспериментальных исследований и является важным шагом на пути разработки клинических рекомендаций по применению статинов в лечении эндометриоза.
