На сегодняшний день проблема бесплодия остается одной из самых актуальных проблем медицины во всем мире и встречается с частотой от 9 до 18% в различных странах [1]. Увеличение частоты выявления бесплодных браков влияет не только на медицинскую сферу, но также на социальную и экономическую сферы государства [2]. Определенное место в структуре бесплодного брака занимают пациентки с низким овариальным резервом; при этом распространенность этой патологии по разным данным варьирует от 5,6 до 35,1% [3].
Овариальный резерв – клинический феномен, обусловленный возрастом, генетикой, аутоиммунными механизмами и факторами окружающей среды. Этот термин используется для описания репродуктивного потенциала и прогнозирования ответа при контролируемой стимуляции овуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий. В соответствии с существующей концепцией возможно развитие трех вариантов сценариев: физиологическое снижение овариального резерва с возрастом, пренатально запрограммированный низкий резерв или снижение овариального резерва в период постнатального развития, связанное с факторами внешнего воздействия или особенностями питания [4]. С клинической точки зрения в эту группу с низким овариальным резервом включены: пациентки с «бедным» овариальным ответом, с преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ) и женщины в позднем репродуктивном возрасте.
Снижение овариального резерва может быть связано с рядом патофизиологических механизмов. Так, одним из них на сегодняшний день признан механизм активации апоптоза в клетках гранулезы. Однако, пока до конца непонятно, есть ли прямая связь между активностью этого процесса и качеством ооцитов [5, 6].
Вторым активно обсуждаемым механизмом снижения функции яичников является дегенеративный феномен, способствующий коллапсу овариального окружения, а также разрыву молекулярной сети, контролирующей васкуляризацию [7]. Недавними исследованиями показано также, что митохондриальная функция также достоверно ассоциирована со «старением» ооцитов и снижением фертильности [8].
На сегодняшний день наиболее успешным является достижение беременности у пациенток с «бедным ответом» или яичниковой недостаточностью при помощи донорских ооцитов; но значительное большинство женщин отрицательно относятся к проведению данных программ и ищут альтернативные решения, несмотря на низкие шансы беременности при попытках использовать собственные ооциты [9].
Наиболее часто используемыми протоколами и средствами в случае «бедного» овариального ответа на сегодняшний день являются: протокол с аналогами гонадотропин рилизинг гормона; андрогены; гормоны роста; естественный цикл или модифицированный естественный цикл; высокие дозы гонадотропинов; глюкокортикоиды; коэнзим Q-10; акупунктура [9].
Текущие стратегии контролируемой стимуляции яичников фокусируют свое воздействие на растущих фолликулах; при этом «дремлющие» примордиальные фолликулы не могут быть активированы известными на сегодняшний день протоколами стимуляции [10].
Исследованиями последних лет показано, что рост фолликулов может быть активирован посредством восстановления адекватного овариального окружения [11]. Подобное воздействие возможно при использовании стволовых клеток, изолированных факторов роста и обогащенной тромбоцитами аутоплазмы (PRP).
Целью настоящего обзора явилась оценка современных возможностей, эффективности и побочных эффектов различных технологий негормональной стимуляции яичников при низком овариальном резерве.
Интраовариальная PRP-терапия (аутоплазмотерапия)
В настоящее время во многих отраслях медицины все чаще используется PRP-терапия. Доказаны противовоспалительный, анальгезирующий и регенерирующий эффекты, а также описаны механизмы стимуляции пролиферации клеток [12].
Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) – это плазма, содержащая тромбоциты в большем количестве, чем в ней содержится в норме. В норме в крови содержится 150 000–400 000/мкл. тромбоцитов, а их концентрация в обогащенной плазме составляет более 1 000 000 /мкл. Применение PRP-терапии позволяет запустить и доставить в пораженную зону факторы роста, способствующие регенерации тканей [13].
Тромбоциты продуцируются мегакариоцитами костного мозга, которые после созревания мигрируют к эндотелиальному барьеру и высвобождают в кровоток предшественники, которые, в свою очередь, будут генерировать тромбоциты. В составе тромбоцитов имеется плазматическая мембрана, в которой содержится большая сеть рецепторов, способствующих запуску внутриклеточных механизмов, позволяющих тромбоцитам выполнять свои многочисленные функции [14].
Основными такими рецепторами являются рецепторы гликопротеина Ib и гликопротеина VI. Их роль заключается в связывании с фактором Виллебранда и коллагеном, благодаря чему происходят конформационные изменения в тромбоцитах и позволяют им связываться с фибриногеном, тканями и другими тромбоцитами, чтобы сформировать тромб. Кроме того, эта активация тромбоцитов также вызывает высвобождение их внутреннего содержимого, что необходимо для регенеративного эффекта при применении PRP [15].
Внутри тромбоцитов содержатся различные гранулы. Это плотные гранулы, α-гранулы и лизосомы. α-гранулы характеризуются более высоким содержанием активных биомолекул, связанных с восстановлением тканей. Были идентифицированы сотни таких молекул, в том числе, адгезивные белки, фибринолитические и коагуляционные факторы, антимикробные молекулы, цитокины и факторы роста. Именно цитокины и факторы роста участвуют в процессах репарации и регенерации тканей, таких, как ангиогенез, хемотаксис, миграция или пролиферация клеток [15].
На сегодняшний день описано более 30 факторов роста, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов. Основными факторами роста являются:
- PDGF (platelet-derived growth factor) – тромбоцитарный фактор роста, отвечает за активацию миграции и пролиферации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, фибробластов, гладкомышечных клеток, остеобластов, активацию миграции моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, активацию макрофагов.
- TGF-β1 (transforming growth factor-beta1) – трансформирующий фактор роста, индуцирует синтез межклеточного матрикса, регулирует пролиферацию кератиноцитов и стимуляцию продукции коллагена.
- VEGF (vascular endothelial growth factor) – фактор роста эндотелия сосудов, стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез, лимфоангиогенез, повышает проницаемость сосудистой стенки.
- EGF (epidermal growth factor) – эпидермальный фактор роста, стимулирует миграцию кератиноцитов, пролиферацию эпителиальных, мезенхимных клеток и фибробластов, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез, регулирует продукцию коллагеназ.
- FGF (fibroblast growth factor) – фактор роста фибробластов, индуцирует пролиферацию фибробластов, стимулирует рост эндотелиальных клеток, стимулирует ангиогенез.
- IGF (insulin-like growth factor) – инсулиноподобный фактор роста, стимулирует пролиферацию фибробластов, синтез коллагена и других компонентов межклеточного матрикса (хондроитины, гиалуронаты) [16, 17].
Такое значительное содержание факторов роста играет ведущую роль в процессах восстановления и регенерации тканей. Плазматические белки крови (фибрин, фибронектин, витронектин и др.) служат в качестве каркаса при регенерации соединительной ткани и миграции эпителиальных клеток [18].
Активация тромбоцитов вызывает высвобождение их гранул, связанных с восстановлением тканей, во внеклеточную среду, где они присоединяются к циркулирующим биомолекулам в плазме. В течение 10 минут тромбоциты производят около 70% факторов роста, а в течение первого часа происходит практически полное их высвобождение. В дальнейшем около 7 дней продолжается синтез дополнительного количества факторов роста [18].
Таким образом, PRP – это множество биомолекул плазмы и тромбоцитов, которые выполняют различные функции, такие как: коагуляция, регулирование гемостаза, воспаление, регенерация тканей, защита от микроорганизмов, а также другие биологические процессы. Но стоит отметить, что весь этот терапевтический эффект во многом зависит от состава, который в свою очередь может варьировать в зависимости от способа получения плазмы.
Активация тромбоцитов осуществляется несколькими путями: экзогенным и эндогенным. Экзогенный путь активации включает в себя физические методы (например, замораживание и оттаивание плазмы), механическое воздействие (вибрация), химические методы (добавление тромбина или хлорида кальция). Эндогенный путь активации подразумевает введение PRP без какой-либо предварительной активации и заключается в физиологической активации тромбоцитов внутри организма [19].
Таким образом, PRP может быть использована в качестве инъекций сразу после активации или в качестве фибриновой мембраны-сгустка через несколько минут после добавления активатора. В этом случае и благодаря своей консистенции эта композиция может быть использована в качестве биологического и аутологичного каркаса при хирургических вмешательствах, способствующих репарации тканей [20].
До настоящего времени механизмы воздействия плазмы на яичниковую ткань остаются неизвестными. По данным ряда авторов, введение PRP достоверно увеличивает перфузию яичниковой ткани за счет повышения количества сосудистого эндотелиального фактора роста [21].
Экспериментальными исследованиями на животных показано, что введение PRP в яичники достоверно активирует фолликулярный рост и снижает интенсивность апоптоза [22].
На сегодняшний день метод интраовариальной аутоплазмотерапии является достаточно новым, и в литературе представлен всего один крупный метаанализ, посвященный обзору этих исследований [23]. Согласно проведенному анализу, лишь 4 исследования, представленные в базе данных PubMed, могут заслуживать внимания: 3 их них – квази-экспериментальные, 1 – нерандомизированное клиническое исследование. Результаты работ, на наш взгляд, сравнить достаточно сложно, поскольку технология применялась в разных возрастных группах пациенток, в том числе, у женщин в пре- и постменопаузе. Более того, были использованы различные протоколы подготовки плазмы, а также варианты и кратность ее введения.
Нами также продемонстрирована эффективность методики интраовариальной аутоплазмотерпии в определенной когорте пациенток с низким овариальным резервом и «бедным» ответом в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), которым ранее предлагалась донация ооцитов: положительное влияние интраовариального введения PRP на функциональное состояние яичников (достоверное снижение ФСГ через 2 месяца после инъекции, повышение эстрадиола через 1 месяц, увеличение количества антральных фолликулов через 2–3 месяца). Подобные изменения позволили включить пациенток в программы контролируемой индукции овуляции с получением ооцитов соответствующего качества (M II): 73,9% в группе до 35 лет и 43,8% – после 35 лет (р=0,032) [24].
Неоспоримыми преимуществами данной технологии, безусловно, является тот факт, что вводимая плазма является аутологичным продуктом, что минимизирует вероятность побочных эффектов в сравнении с потенциальным использованием гетерологичных образцов. Показано также, что введение плазмы обладает значительным положительным anti-age эффектом [24]. Однако, на сегодняшний день не существует стандартизации проведения этой процедуры, что, по-видимому, и объясняет гетерогенность получаемых результатов. Ряд данных свидетельствует о том, что концентрация PRP является ключевым фактором клеточной пролиферации и дифференцировки мезенхимальных клеток. Однако, персонифицированный подход к ведению таких пациенток, включающий оценку корректируемой патологии в случаях низкого овариального резерва, отсутствует. Также остаются неясными механизмы воздействия, кратность введения, необходимый объем вводимого вещества, а также максимальное количество возможных потенциальных инъекций [25].
Трансплантация стволовых клеток
Терапия стволовыми клетками в последние два десятилетия активно используется в ключе регенеративной медицины. Термин «стволовые клетки» используется для описания широкого спектра недифференцированных клеток человека, обладающих способностью к самообновлению, пролиферации и дифференцировке в различные органы и тканеспецифичные типы клеток. В гинекологии на сегодняшний день стволовые клетки применяются, как для регенерации эндометрия при синдроме Ашермана, так и для активации функции яичников при сниженном овариальном резерве [26, 27].
Основное количество исследований сфокусировано на использовании мультипотентных клеток и, особенно, мезенхимальных стволовых клеток, в качестве терапевтического инструмента лечения ПНЯ. Их особенные свойства включают недифференцированность, пролиферацию и способность к самообновлению. Более того, уникальный профиль мультипотентных клеток снижает опухолевые риски и повышает выживаемость стволовых клеток в организме, что способствует более эффективному и надежному лечению [28]. Кроме того, мультипотентные клетки способны модулировать иммунный ответ, а также обладают высокими противовоспалительными свойствами, продуцируя противовоспалительные цитокины, включающие семейство интерлейкинов, фактор некроза опухоли и интерферон γ. Более того, рядом исследований продемонстрировано антиапоптотическое свойство стволовых клеток, стимулирующее тканевую регенерацию [29]. Интересно, что яичники обладают способностью «привлекать» некоторые типы недифференцированных клеток из других органов и тканей, особенно, из костного мозга. Эти клетки мигрируют в яичники, активируя фолликулогенез посредством секреции ряда факторов роста и гормонов, регулирующих овариальную функцию [30].
Технология использования стволовых клеток была впервые описана 25 лет назад Sanders et al., который опубликовал ретроспективное исследование, демонстрирующее наступление самостоятельной беременности у пациенток с ПНЯ после трансплантации костного мозга [31]. Однако и на сегодняшний день эта процедура является экспериментальной. Несмотря на то, что стволовые клетки характеризуются низким иммунологическим профилем, аллогенная трансплантация может приводить к серьезным осложнениям [32]. На сегодняшний день описано 2 варианта введения стволовых клеток в яичники: субкортикальные инъекции при лапароскопии и введение в яичниковую артерию под контролем ультразвука; при этом оба метода признаны одинаково эффективными [33].
Наиболее опасным осложнением использования стволовых клеток являются риски злокачественной трансформации и метастазирования [34]. Именно поэтому, учитывая отсутствие данных о необходимом количестве и кратности введения, достаточно сложно достичь баланса между эффективностью и безопасностью.
Активация in vitro
Фолликулогенез человека – это сложный процесс, который регулируется гормонами, паракринными и аутокринными факторами происхождения ооцитов и гранулезных клеток. Из большого количества примордиальных фолликулов, располагающихся в яичнике, только некоторые инициируют рост, развиваясь до первичной стадии под контролем серин/треонинкиназы через два сигнальных пути: протеинкиназу В (Akt) и механическую мишень рапамицина (mTOR) у млекопитающих [35]. Путь Akt, или фосфоинозитид-3-киназа (PI3K)-Akt, является сигнальным трансдукционным путем, который способствует выживанию, росту и пролиферации в ответ на ооцитарные и гранулезоклеточные производные факторы. После активации примордиальные фолликулы начинают расти и переходят на первичную и вторичную стадии развития под влиянием паракринных факторов, а затем фолликулостимулирующего гормона [36].
Напротив, сдерживание роста преантральных фолликулов осуществляется ингибирующим сигнальным путем Hippo, что способствует повышению концентрации факторов роста CCN и ингибиторов апоптоза BRСA1,7, способных стимулировать рост фолликулов [37]. Поддержание и сохранение адекватного овариального резерва зависит от баланса между активирующими и ингибирующими факторами.
Экспериментальные литературные данные позволяют предположить, что не только внешние стимулы, но и сами ооциты в значительной степени управляют передачей сигналов, регулирующих набор и скорость роста фолликулов. В течение почти 100 лет было известно, что повреждение яичников может способствовать фолликулярному росту; однако только в настоящее время появилось убедительное научное обоснование указанного положения. Пионерами создания нового понимания раннего фолликулогенеза являются ученые Стенфордского университета во главе с A. Hsueh. Исследователи показали, что сигнальный путь Hippo ограничивает, а CNN факторы роста стимулируют преантральный фолликулярный рост [38].
Hippo является ведущим эволюционным сигнальным путем, контролирующим размеры органа во всех многоклеточных организмах, ингибирует пролиферацию клеток и стимулирует апоптоз (определяет дальнейшее развитие стволовых/прогениторных клеток). Сигнализация состоит из нескольких негативных регуляторов роста, действующих на каскад серин/треонинкиназы, в конечном итоге фосфорилирует и инактивирует ключевые транскрипционные коактиваторы YAP и TAZ (эффекторы Hippo-супрессорного пути, обладающие пролиферативной и онкогенной активностью). После активации и выхода из состояния покоя локальные сигналы Hippo определяют различную траекторию роста фолликулов, связанную с этим разную продолжительность их жизни (23–90 дней). Таким образом, негормональная in vitro активация позволяет воздействовать на hippo-сигнальный путь, позволяющий активировать рост «дремлющих» фолликулов. Было доказано, что нарушение пути Hippo (которое происходит при фрагментации ткани яичников) в сочетании со стимуляцией Akt путем применения ингибиторов фосфатазы и гомологов тенсина (PTEN) и/или стимуляторов PI3K, действительно способствует росту преантральных фолликулов [38].
Механобиология изучает, как физическое воздействие и изменение механических свойств клеток и тканей регулирует дифференцировку и пролиферацию, влияя на клеточную биохимию и экспрессию генов [39]. Механотрансдукция – процесс, посредством которого клетка реагирует и отвечает на механические сигналы посредством изменения состояния экстрацеллюлярного матрикса. Hippo-сигнальный путь является основой механотрансдукции [40].
В 2013 г. было введено понятие «активация in vitro» (IVA) для лечения пациенток с ПНЯ, планирующих беременность. Сутью этой процедуры является аутотрансплантация фрагментированного коркового вещества яичника [41]. В исследованиях описаны два варианта IVA:
- Drug-free – только фрагментация и имплантация ткани яичника, что приводит к прерыванию внутриклеточного сигнального Hippo-пути, повышению экспрессии факторов роста и ингибиторов апоптоза;
- Обработка яичниковой ткани активаторами AKT-пути PI3K стимуляторов и PTEN ингибиторов (с добавлением их к фрагментам в лаборатории [42]. В этом случае