В последнее десятилетие заметно возрос интерес исследователей к изучению молекулярно-биологического состояния репродуктивной системы и его взаимосвязи с микробиотой. Необходимо понимать, что эволюция человека происходила вместе с триллионами микробов, которые населяют его организм и создают сложные экосистемы, адаптированные к изменчивой физиологии хозяина.
Термин «микробиота» был впервые предложен в 2001 г. Джошуа Ледербергом, который использовал его для обозначения «экологического сообщества комменсальных, симбиотических и патогенных микроорганизмов» [1]. Как известно, организм человека содержит различные виды микроорганизмов, их количество в 3 раза превышает клеточный состав тела [2–4]. Стало очевидным, что микроорганизмы способны влиять на многие физиологические процессы человека, поддерживая врожденный и адаптивный иммунитет, защищая от патогенов за счет формирования колонизационной резистентности и продукции специфических антимикробных пептидов (бактериоцинов), участвуя в процессах расщепления непереваренных компонентов пищи и обеспечивая производство ряда жизненно необходимых витаминов (кобаламина, фолиевой кислоты, биотина, тиамина и др.) и короткоцепочечных жирных кислот [5]. Микробиота (микрофлора) представляет собой совокупность микроорганизмов разных областей тела человека (биотопов), находящихся с ним в симбиозе. Микробиологические сообщества включают широкий спектр микроорганизмов, таких как эукариоты, архибактерии, бактерии и вирусы. Разнообразие состава микробиоты здорового человека зависит от генетических особенностей, возраста, характера и режима питания, экологической обстановки и ряда других причин [6].
Анализ данных литературы показал возрастающий интерес ученых к изучению роли микробиоты в развитии целого ряда патологических состояний. Это обусловлено ее клинической значимостью уже с первых дней жизни. Установлено, что микробиота новорожденного во многом определяется состоянием различных биотопов матери (родовых путей, кожных покровов, кишечника), а также зависит от способа родоразрешения и характера вскармливания. Согласно имеющимся данным, нарушение гомеостаза микробиота–хозяин играет роль в развитии ожирения, сахарного диабета 2 типа, ряда онкологических заболеваний, воспалительных процессов, аллергических состояний и даже психических расстройств. В последние годы предметом молекулярной биологии стало изучение микробиома – совокупности генов микробиоты различных биотопов человека. В 2012 г. были опубликованы результаты пятилетнего проекта 80 Национальных институтов здоровья США «Микробиом человека» (Human Microbiome Project). По результатам анализа биоматериала выявлено около 22 000 генов в геноме человека и почти 8 млн кодирующих генов в микробиоме. Примерно 9% всего микробиома приходится на урогенитальный тракт [7]. До недавнего времени интерес исследователей был сфокусирован на изучении микробиома кишечника жителей разных стран и континентов, в том числе Российской Федерации [8]. Однако большинство исследований носит описательный характер, а механизмы взаимодействия микробиома и организма человека остаются до сих пор недостаточно изученными. Это касается и микробиоты репродуктивного тракта женщин. Она представляет собой сложную систему, в состав которой входят микроорганизмы практически всех таксономических единиц (т.е. совокупности особей с единым генотипом, которые в стандартных условиях проявляются сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками; к ним относится вид, род, семейство и т.д.) [9]. Исследования микробиома различных биотопов репродуктивной системы имеют важное значение для уточнения его роли в развитии различных патологических состояний и заболеваний с целью последующей разработки эффективных методов профилактики и терапии.
К настоящему времени стало известно, что примерно 80% микроорганизмов, колонизирующих различные биотопы организма человека, невозможно идентифицировать с помощью культуральных методов, которые до последнего времени считались золотым стандартом диагностики любого инфекционного процесса [10]. При этом в последние годы увеличивается интерес микробиологов мира к изучению микробиоты методом культуромики – проведение микробиологического исследования с применением расширенной панели питательных сред. Цель такого исследования заключается в выделении максимально широкого спектра живых микроорганизмов и изучении их роли в норме и развитии патологических состояний. С современных позиций оценку микробиоты можно осуществить с помощью исследований, основанных на метаболомике, позволяющей анализировать низкомолекулярные метаболические соединения в определенный момент времени. Времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF-MS) признана сегодня одним из лучших методов идентификации выделенных микроорганизмов, обладающих высокой чувствительностью и быстротой выполнения исследования, однако идентификация ограничивается теми белками, которые были определены у ранее секвенированных микробов [11, 12]. Развитие молекулярных методов диагностики, таких как ДНК-секвенирование, сделало возможным оценить геномное разнообразие микроорганизмов без культивирования. Существует два формата метагеномного секвенирования. В последние годы наиболее распространенным методом оценки микробиома является секвенирование определенного филогенетического маркера – последовательности азотистых оснований в генах 16S рибосомальной РНК (рРНК). Преимущество гена 16S рРНК заключается в его эволюционной консервативности (малой подверженности мутациям) и универсальности для большинства микроорганизмов (встречается в геномах всех прокариот). Несмотря на то что этот метод является качественным, он обладает высокой специфичностью, позволяя получить данные о таксономических единицах, родовой или видовой принадлежности микробов. Обнаружение микроорганизмов с помощью таргетного секвенирования рРНК основано на имеющихся знаниях о нуклеотидных последовательностях и функциях выявленных ранее таксонов.
В отличие от таргетного, полногеномное секвенирование, основанное на анализе всей ДНК, присутствующей в образце, позволяет охарактеризовать весь геном микроорганизмов и получить информацию о потенциальном взаимодействии бактериального сообщества с хозяином. Некоторые ограничения метода касаются его высокой стоимости, сложности анализа полученной информации, а также отсутствия полных баз данных по ряду таксонов микробиоты [9]. Полногеномный анализ, как и метод таргетного секвенирования рРНК, не позволяет получить различия между живыми или мертвыми микроорганизмами. Однако в доступной литературе не представлены данные об исследовании микробиома биотопов репродуктивной системы методом полногеномного секвенирования.
Наибольшее внимание при исследовании микробиома репродуктивного тракта уделено изучению влагалищного биотопа. В проекте «Микробиом человека» подробно описано физиологическое состояние микробиома влагалища [7]. Он достаточно динамичен, характеризуется колебаниями видового состава и численности бактерий в зависимости от этнической принадлежности, возраста женщины, фазы менструального цикла, уровня эстрогенов, сексуальной активности и гигиены [13]. Молекулярные исследования, основанные на индикации гена 16S рРНК бактерий, выявили во влагалище 265 видов микроорганизмов [14, 15]; среди них доминируют (до 20 видов) Lactobacillus [16], их доля составляет 85–90%. Среди других бактериальных сообществ наиболее распространены Prevotella, Gardnerella, Atopobium, Sneathia, Bifidobacterium, Megasphaera, Anaerococcus и т.д. [17]. В вагинальном микробиоме вне беременности выделяют 5 основных сообществ: Lactobacillus (community state types (CST)) [18]. В 4/5, характерных, как правило, для представительниц европейских и азиатских народов, преобладают представители таких видов, как L. crispatus (СST-I), L. gasseri (CST-II), L. iners (CST-III) и L. jensenii (CST-V).
IV тип микробиома (CST-IV), часто встречающийся у афроамериканских и латиноамериканских женщин, характеризуется низким уровнем Lactobacillus spp. и большим числом анаэробных бактерий. Это повышает риск развития специфических и неспецифических воспалительных гинекологических заболеваний. CST-IV подразделяют на два подтипа: CST IV А содержит анаэробные бактерии Anaerococcus, Peptoniphilus, Prevotella и Streptococcus, а CST IV В характеризуется доминированием Atopobium и Megasphaera [19].
Известно, что эстрогены способствуют отложению гликогена в эпителии влагалища, прогестерон – цитолизу эпителиальных клеток с высвобождением гликогена, а лактобациллы метаболизируют гликоген в молочную кислоту, поддерживая кислую среду влагалища (рН 3,8–4,5). В период овуляции на фоне возрастания эстрогенной насыщенности вагинальный микробиом характеризуется доминированием Lactobacillus и максимальной кислотностью среды. Во время менструации снижение концентрации гликогена, связанное с падением уровня эстрогенов, приводит к повышению pH и риску дисбиотических нарушений [13, 18]. В постменопаузе, на фоне дефицита эстрогенов и снижения пролиферации влагалищного эпителия, отмечается значительное снижение гликогена – питательной среды для Lactobacillus. На фоне снижения их общего количества преобладающими становятся L. iners и L. crispatus. Так, Hyman R. и cоавт. продемонстрировали взаимосвязь вагинального микробиома в день переноса эмбриона с частотой имплантации [20], которая была наиболее высокой при доминировании Lactobacillus (L. crispatus, L. jensenii, L. fornicalis, L. gasseri). По некоторым данным, бактериальный вагиноз, часто выявляемый при бесплодии, ассоциируется с ранними потерями беременности [21]. Наличие Gardnerella vaginalis и Atopobium vaginae связывают со снижением частоты наступления беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРT) [22].
Нормальный биоценоз влагалища обеспечивает колонизационную резистентность, играя важную роль не только в наступлении, но и в нормальном течении беременности. Однако у европейских и азиатских женщин во время беременности могут происходить некоторые сдвиги между типами микробиологических сообществ, при этом достаточно редко наблюдается IV тип бактериального сообщества [23]. В настоящее время продолжается изучение роли микробиома влагалища в успешном наступлении беременности и развитии различных заболеваний женской репродуктивной системы.
В последние годы появились публикации, подтверждающие связь микробиома кишечника и влагалища с эндометриозом [24–26]. В одном из исследований 2018 г. были проанализированы образцы содержимого кишечника, влагалища и шейки матки [26]. Авторы обращают внимание на полное отсутствие Atopobium в образцах отделяемого влагалища и в шейке матки, а также на увеличение микроорганизмов видов Gardnerella, Escherichia, Shigella и Ureаplasma в микробиоме шейки матки пациенток с эндометриозом. Однако причастность отсутствия Atopobium к развитию эндометриоза пока не доказана. В экспериментальных исследованиях на макаках было выявлено более высокое разнообразие кишечной микрофлоры при эндометриозе в сравнении со здоровыми.
В когортном исследовании авторы показали наличие дисбактериоза кишечника у каждой второй больной с эндометриозом. Возможно, кишечный и вагинальный дисбиоз активируют выброс провоспалительных цитокинов (интерлейкины (ИЛ)-1, -17, -8), меняют гомеостаз стволовых клеток, повышают уровень эстрогенов, способствуя росту эндометриоидных гетеротопий [27]. Можно полагать, что детальное изучение микробиома влагалища и кишечника в будущем позволит оптимизировать принципы диагностики эндометриоза и совершенствовать подходы к его профилактике и терапии.
Одним из ключевых звеньев, определяющих фертильность женщины, является функциональный потенциал эндометрия, обеспечивающий успешную имплантацию эмбриона. Этот сложный процесс требует синхронности между здоровым эмбрионом и функционально полноценным эндометрием. Повторные неудачи имплантации являются частой причиной бесплодия, безуспешных попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и нередкой основой привычного выкидыша. Профилактика указанных нарушений предусматривает терапию таких заболеваний, как хронический эндометрит (ХЭ), гиперплазия и полипы эндометрия (ПЭ), эндометриоз.
Эндометрий, подобно кишечнику, представляет иммунологически подходящую нишу для колонизации микроорганизмов. Известны три типа иммунологических барьеров, необходимых для кишечного микробного гомеостаза. Они включают: 1) анатомические особенности, способствующие ограничению воздействия бактерий на системный иммунитет; 2) иммунологические медиаторы, ограничивающие прямой контакт микроорганизмов с однослойным эпителием; 3) систему обнаружения и мгновенного уничтожения патогенов на этапе их проникновения. Слой эпителиальных клеток эндометрия, пролиферирующих в секреторной фазе менструального цикла с образованием железистых клеток, может выполнять защитную функцию [28]. Система врожденного иммунитета активизируется путем связывания микроорганизмов с толл-подобными рецепторами фагоцитов и эпителиальных клеток, что приводит к секреции антимикробных пептидов, выделению хемокинов, которые привлекают в пораженный участок фагоциты, запускают цитокиновый каскад, активирует натуральные киллеры и лимфоциты [29]. Изучение патофизиологического взаимодействия микробиома с клетками эндометрия и иммунной системы представляется перспективным для более глубокого понимания процессов имплантации, регенерации эндометрия, а также генеза некоторых заболеваний женского репродуктивного тракта.
При исследовании микробиома эндометрия всегда проводится его сравнительная оценка с микробиомом влагалища. Существует предположение, что микробиота различных биотопов организма может мигрировать между собой. В связи с этим представляется целесообразным проводить одновременное исследование микробиоты слизистых оболочек различных биотопов не только генитального, но и кишечного тракта, а возможно, и респираторного, что позволит прогнозировать развитие патологического процесса [30].
До недавнего времени доминировала точка зрения о том, что колонизация верхних отделов половых путей микробами осуществляется исключительно восходящим путем из влагалища. Наличие собственной микробиоты в полости матки, не ассоциированной со значимым воспалительным процессом, было описано в 2015 г. в исследовании Mitchel M. и cоавт. Авторами представлена сравнительная оценка микробной обсемененности образцов влагалища и эндометрия, полученных при гистерэктомии, произведенной по поводу доброкачественных заболеваний матки у женщин позднего репродуктивного возраста и постменопаузы (средний возраст 43±7 лет). Выявлено 12 родов микроорганизмов, из них наиболее частыми были Lactobacillus и Prevotella. Среднее количество микроорганизмов в полости матки было значительно меньше, чем во влагалище. При этом превалировали L. iners (45 и 61%), Prevotella spp. (33 и 76%), L. crispatus (33 и 56%), реже выявлялись G. vaginalis, A. vaginae и L. jensenii. Поскольку низкий уровень колонизации микроорганизмов в эндометрии не приводит к активации маркеров воспаления, авторами сделано заключение, что он, вероятно, не является патологическим [30]. Подобно микробиоте кишечника, микробиота полости матки, возможно, играет роль в иммунологическом гомеостазе, предотвращая развитие воспаления. Полагают, что при отсутствии патологической воспалительной реакции эндометрия наличие определенного микробного сообщества может способствовать поддержанию нормального гомеостаза эндометрия. В ответ на присутствие комменсальных микроорганизмов (приносящих пользу организму человека), таких как Bacteroides, которые составляют до 30% микробиоты эндометрия, поддерживается циклическая регенерация эндометрия [31, 32] за счет активации дифференцировки, проницаемости эпителиальных клеток и усиления васкуляризации [33, 34].
В настоящее время имеются лишь единичные исследования о состоянии нормального микробиома эндометрия. Так, Walther-António M. и соавт. методом секвенирования гена 16S РНК изучили микробное сообщество полости матки 22 здоровых женщин репродуктивного возраста и показали, что среди 191 таксономической единицы в микробиоме влагалища и эндометрия доминировали Lactobacillus spp. (71,7%). По этим данным, достаточно распространенными микроорганизмами были Gardnerella (12,6%), Bifidobacterium (3,7%), Streptococcus (3,2%) и Prevotella (0,8%). Оценка репродуктивных исходов у женщин с бесплодием выявила ассоциацию недостаточности Lactobacillus (<90% от количества других бактерий) со снижением частоты имплантации, наступления беременности и живорождения [35]. Хотя существуют данные о том, что при признаках воспаления дефицит Lactobacillus можно считать вариантом нормы [18].
Анализ литературы показал, что большинство исследований касаются изучения микробиоты эндометрия при бесплодии в программах ЭКО. Так, Franasiak и соавт. [36] установили, что независимо от исхода ВРТ наиболее распространенными таксонами в эндометрии были Flavobacterium и Lactobacillus. По данным Tao Х. и соавт. [37], во время переноса эмбриона в эндометрии доминируют Lactobacillus, их доля превышает 70–90%. Наряду с этим, были обнаружены микроорганизмы рода Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus и Bifidobacterium. Авторами этих двух исследований не сделаны конкретные выводы о характере колонизации микроорганизмов при бесплодии и влиянии их на исходы программ ЭКО, что, вероятно, связано с малой выборкой пациенток и отсутствием группы контроля.
По данным Verstraelen Н. и соавт. [38] показано, что у 17/19 (90%) женщин с повторными неудачами имплантации и привычным выкидышем в микробиоме эндометрия доминируют микроорганизмы родов Bacteroides и Pelomonas.
В 2018 г. Kyono K. и соавт. [39] представили схожие данные о недостаточности Lactobacillus (<90%) в образцах эндометриальной жидкости и вагинального отделяемого женщин с бесплодием (38 и 44,3%) в сравнении со здоровыми добровольцами – в 85,7 и 85,7% соответственно. Среди других таксономических единиц были выявлены Gardnerella, Streptococcus, Atopobium, Bifidobacterium, Sneathia, Prevotella, Staphylococcus. Процентное соотношение Lactobacillus в эндометрии здоровых женщин было стабильным в течение всего менструального цикла. У пациенток с успешно наступившими беременностями среднее содержание Lactobacillus составило 96,45±33,61%. Авторы делают заключение, что уровень лактобацилл >90% во влагалище можно рассматривать как один из прогностических факторов успешной имплантации в программах ЭКО. Наличие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, возможно, следует рассматривать как одну из вероятных причин рецидивирующей имплантационной недостаточности и привычного выкидыша.
Известно, что при различных патологических состояниях происходит уменьшение количества видов и родов микроорганизмов. При исследовании кишечного микробиома выявлено, что низкое количество генов бактерий LGC (low gene count) характерно для пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и с ожирением [40]. Вероятно, оценка числа генов в микробиоме может также стать информативным методом диагностики воспалительных заболеваний не только кишечника, но и органов репродуктивной системы, таких как ХЭ.
Несомненный научный интерес представляют немногочисленные исследования по изучению микробиома матки при гиперпластических процессах и раке эндометрия (РЭ). Fang R.L. и соавт. [41] методом таргетного секвенирования изучили микробиом полости матки 10 женщин без патологии эндометрия и 20 – с ПЭ, в том числе в сочетании в ХЭ. В группе с ПЭ доминировали Lactobacillus, Bifidobacterium, Gardnerella, Streptococcus, Alteromonas и Pseudomonas; в группе здоровых женщин – Enterobacter, Pseudomonas и Lactobacillus. Не обнаружено существенных различий в микробиоме при ПЭ в зависимости от наличия или отсутствия ХЭ. Это поддерживает гипотезу о том, что бактериальная обсемененность не всегда сопровождается развитием воспалительного процесса ввиду наличия комменсальных бактерий.
По данным ряда исследований, такой представитель кишечной микробиоты, как Enterobacter, может оказать ингибирующий эффект на пролиферацию клеток [42, 43]. В связи с этим можно предположить, что снижение Enterobacter может играть роль в активации пролиферации и формировании ПЭ. В более ранних исследованиях показано, что Lactobacillus и Bifidobacterium могут играть роль в ингибировании апоптоза. Возможно, это также имеет значение в развитии ПЭ, поскольку при их наличии доминируют Lactobacillus. Однако в связи с малочисленностью исследований и выборок больных роль внутриматочного микробиома в генезе ПЭ остается неуточненной, как и причинно-следственные связи с микробиомом эндометрия.
В ряде исследований изучалась возможная ассоциация между микробиомом эндометрия и развитием гипер- и неопластических процессов [35, 44]. Сравнительная оценка микробиома эндометрия, маточных труб, яичников, шейки матки и влагалища выявила схожесть микробиомов при РЭ и гиперплазии эндометрия и их отличие от микробиома пациенток без патологии эндометрия. В эндометриальном микробиоме всех образцов установлено преобладание Shigella и Barnesiella, в группе с доброкачественной патологией матки – Staphylococcus, Blautia и Parabacteroides, в группе с РЭ – Bacteroides и Faecalibacterium. Atopobium и Porphyromonas были выявлены при РЭ и практически отсутствовали при доброкачественной патологии матки. При РЭ часто выявлялось сочетание A. vaginae и Porphyromonas spp. (чувствительность – 73% и специфичность – 90%), при рН влагалища >4,5 чувствительность повышалась до 100%. Целесообразным представляется оценить роль различных видов Lactobacillus у пациенток с РЭ и определить эту взаимосвязь с высоким pH [45] или другими факторами, способствующими повышению рН влагалища при РЭ. Авторы предполагают, что A. vaginae может способствовать инфицированию микроорганизмами рода Porphyromonas, которые могут существовать внутриклеточно [46], нарушая регуляторные функции клетки, и приводить к активации процессов канцерогенеза [35]. Как известно, воспаление потенцирует пролиферативную активность эпителия и стромы эндометрия, способствуя трансформации клеток. Так, в ряде эпидемиологических исследований показана связь между локальным воспалением, ассоциированным с Helicobacter pylori и раком желудка [47], а также колоректальным раком [48].
Одним из факторов риска РЭ является ожирение [49], при котором выявлены различия в микробиоме в сравнении со здоровыми людьми, имеющими нормальный индекс массы тела. Известно, что кишечник человека имеет самый большой микробиом, 90% его составляют Firmicutes и Bacteroides [50, 51]. При ожирении наблюдается увеличение Firmicutes и уменьшение Bacteroides. Однако до настоящего времени неизвестно, является ли ожирение причиной или следствием дисбиоза кишечника. Предполагают, что микробиом кишечника взаимосвязан с эстрогенами, которые активны в деконъюгированной форме с помощью фермента β-глюкуронидазы, этому способствует кишечная микробиота [52–54]. Не исключено, что состав микробиома может влиять на риск возникновения РЭ как за счет ожирения, так и за счет изменения метаболизма эстрогенов – повышения уровня эстрона [55]. В настоящее время существует такое понятие, как эстроболом, он отражает совокупность бактерий, продукты которых способны метаболизировать эстрогены. Возможно, что нарушение эстроболома приводит к увеличению циркулирующих эстрогенов и, как следствие, к повышению риска РЭ [44].
Заключение
Таким образом, становится все более очевидной взаимосвязь нарушений микробиома с развитием доброкачественных и злокачественных заболеваний. Однако результаты проведенных исследований вызывают большое количество вопросов, касающихся молекулярных механизмов нарушения тканевого и клеточного гомеостаза между микробиотой и организмом человека при различных патологических процессах эндометрия. Остается непонятным, способствуют ли изменения иммунной и эндокринной систем нарушению микробиома, или изменение соотношения микроорганизмов создает фон для развития заболеваний репродуктивного тракта. Современные молекулярно-генетические методы и развитие методов культуромики позволяют продолжить серию исследований микробиома репродуктивного тракта, прежде всего у здоровых женщин, с созданием базы данных микроорганизмов, с помощью которой станет возможным изучение микробиома при различных патологических состояниях репродуктивной системы.
