Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) занимает одно из ведущих мест в ряду инфекционных заболеваний нижнего отдела репродуктивной системы женщин. По меньшей мере 75% женщин хотя бы раз в течение жизни предъявляют жалобы, характерные для ВВК [4,6,10]. По различным оценкам, у 5—10% женщин с ВВК заболевание приобретает хроническое рецидивирующее течение с 4 и более обострениями в течение года [10].
Ключевую роль в иммунном ответе при кандидозе играют макрофаги и нейтрофилы, обеспечивающие фагоцитоз и уничтожение возбудителя непосредственно на слизистых оболочках нижних отделов репродуктивной системы. Фагоцитоз сопровождается синтезом в макрофагах ряда цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 и др.), сигнализирующих о внедрении патогенов и обеспечивающих привлечение клеток иммунной системы в очаг воспаления. Эффективность фагоцитоза обеспечивается вовлечением в данный процесс CD4+-Т-хелперов 1-го типа (Th1), которые вырабатывают IFN-γ , тем самым усиливая фагоцитирующие функции макрофагов.
Клетки слизистой оболочки влагалища не только создают механический барьер для инфекционных агентов, но также принимают участие в процессинге и презентации чужеродных антигенов, а также вырабатывают множество медиаторов иммунной системы (хемокины, интерлейкины и др.), которые непосредственно осуществляют и регулируют как врожденный, так и адаптивный иммунитет [3]. В связи с важностью установления причин возникновения хронической кандидозной инфекции актуальным является изучение спектра цитокинов при данной инфекции.
Определение уровня белков цитокинов методом иммуноферментного анализа до недавнего времени было единственным способом изучения функционирования и значения цитокинов при разных патологических состояниях, в том числе и при кандидозной инфекции. С разработкой ПЦР-технологий использования флюоресцентномеченных проб и детекции результатов в режиме реального времени появилась возможность полноценной количественной оценки уровня мРНК генов цитокинов.
Несмотря на огромное число публикаций, посвященных проблеме ВВК, мы не нашли работ по количественному определению мРНК генов цитокинов непосредственно в клетках вагинального отделяемого у пациенток с кандидозной инфекцией, поэтому настоящее исследование посвящено изучению профиля экспрессии мРНК генов цитокинов методом ОТ-ПЦР.
Материал и методы исследования
Обследовано 76 женщин репродуктивного возраста — от 19 до 46 лет, из них у 34 был верифицирован хронический рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз (ХРВК). У 19 женщин ВВК был выявлен в виде моноинфекции, у 15 — в сочетании с бактериальным вагинозом (БВ). Все женщины с ХРВК были обследованы в период обострения заболевания. Контрольную группу составили 23 клинически здоровые женщины. В группу сравнения были включены 19 женщин с классическим БВ.
Для постановки диагноза ХРВК и БВ проводили клиническое и гинекологическое обследование: сбор анамнестических данных, жалоб пациентки, осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование.
Микробиологическая диагностика основывалась на оценке состояния микроценоза влагали-ща по результатам комплексного исследования: микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по Граму, и культурального исследования влагалищного содержимого.
Для исследования микрофлоры влагалища методом ПЦР взятие материала (вагинальные соскобы с заднебоковых стенок влагалища) осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. При исследовании состава микробиоты влагалища использовали наборы «Проба ГС» и «Фемофлор» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции. При количественной оценке биоценоза учитывали общую бактериальную массу, массу Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору, включая Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis, Fusobacterium spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Candida spp. и др. Также было проведено обследование женщин методом ПЦР на наличие абсолютных патогенов.
мРНК генов цитокинов (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12α/p35, IL-10, IFN-γ, TGF-β1, LIF, а также общий лейкоцитарный антиген CD45) определяли с помощью метода ОТ-ПЦР.
Во избежание деградации РНК взятие материала (вагинальные соскобы) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоционата. В работе использовали коммерческие реактивы («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции.
Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК генов использован метод сравнения индикаторных циклов (метод ΔΔCq) с нормировкой по пяти референсным генам — HPRT1, TBP, B2M, GUSB, ABL. За 1 было принято значение медианы (Ме) в контрольной группе (рис.1, см. на вклейке) и в группе с БВ (рис. 2, см. на вклейке).
При статистической обработке данных в качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана Me. Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна—Уитни для несвязанных совокупностей.
Результаты исследования и обсуждение
По данным ПЦР-анализа, у всех женщин отсутствовали абсолютные патогены:Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis.
Всем пациенткам, включенным в исследование, диагноз ХРВК и БВ был поставлен на основании жалоб, гинекологического осмотра, клинических проявлений заболевания и подтвержден данными микроскопии вагинальных мазков, культурального исследования.
Большинство пациенток (28 из 34, или 82,3%) с ХРВК предъявляли жалобы на зуд во влагалище. При этом зуд в области вульвы и перианальной области отмечен у 20 (58,8%) женщин, выделения из половых путей — у 19 (55,9%) пациенток, жжение в области наружных половых органов — у 13 (38,2%), дизурические расстройства — у 15 (44,1%) пациенток. Гиперемия и отек слизистой влагалища разной степени выраженности имелись у всех 34 женщин с ХРВК.
По результатам исследования биоценоза влагалища у пациенток с ХРВК в виде моноинфекции при наличии Candida spp. большая часть бактериальной массы была представлена Lactobacillus spp., доля условных патогенов не превышала 5%, Ureaplasma spp. выявлена у 6 (32%) пациенток, только в одном случае количество Ureaplasma spp. было более 105 геном-эквивалентов (гэ) на образец.
Среди пациенток с сочетанием ХРВК и БВ доля лактобактерий у 9 (60%) женщин была резко снижена (менее 25%), а доля условно-патогенных микроорганизмов во всех случаях была более 10%, Ureaplasma spp. выявлена у 9 (60%) пациенток в количестве более 105 гэ/образец. Условно-патогенная флора представлена в основном анаэробами.
Группу сравнения составили 19 пациенток с БВ. У 18 (94,7%) женщин основной жалобой были обильные гомогенные выделения из половых путей, у 16 (84,2%) пациенток с неприятным запахом. В группе сравнения признаков воспали-тельной реакции со стороны влагалища и вульвы не выявлено. По результатам исследования с использованием набора «Фемофлор» в данной группе пациенток был снижена доля лактобактерий, а доля условно-патогенной флоры составила более 10% от общей бактериальной массы. У 14 (74%) пациенток обнаружена Ureaplasma spp., из них в половине случаев в количестве более 105 гэ/образец. M.hominis выявлена у 3 (16%) пациенток.
В контрольную группу были отобраны 23 условно-здоровые женщины, не предъявлявшие жалоб и по результатам клинико-лабораторных исследований не имеющие воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы. Количественная оценка состояния биоценоза влагалища показала, что большая часть бактериальной массы была представлена Lactobacillus spp., доля условных патогенов не превышала 7%. У 5 (22%) пациенток обнаружена Ureaplasma spp. в количестве менее 105 гэ/образец, M. hominis и Candida spp. не выявлены.
Количественные значения и профиль экспрессии мРНК генов цитокинов и СD45 в исследуемых группах представлены на рис. 1 (см. на вклейке).
Исследование показало, что при ХРВК в виде моноинфекции по сравнению с контрольной группой были достоверно повышены уровни мРНК TNF-α (Me=2,7, p=0,0027), IL-1β (Me=8, p=0,00005), IL-6 (Me=127, p=0,015), IL-8 (Me=3,8, p=0,0061), IFN-γ (Me=3,4, p=0,0099), IL-10 (Me=2,9, p=0,00056), а также СD45 (Me=3, p=0,0040), а уровень экспрессии IL-12α (Me=0,38, p=0,0030) и IL-18 (Me=0,24, p=0,000005) был достоверно ниже, чем в контроле.
При БВ по сравнению с контрольной группой было отмечено достоверное снижение уровня экспрессии IL-12α (Me=0,22, p=0,00054) и IL-18 (Me=0,16, p=0,000031) и достоверное повышение IL-6 (Me=554, p=0,00037), IL-10 (Me=2, p=0,0047), а также LIF (Me=12,4, p=0,0041).
При сочетании ХРВК с БВ профиль экспрессии генов цитокинов был идентичен профилю экспрессии генов цитокинов при ХРВК в виде моноинфекции. При ХРВК в сочетании с БВ были достоверно повышены уровни мРНК TNF-α (Me=1,6, p=0,048), IL-1β (Me=5,1, p=0,0013), IL-6 (Me=111, p=0,045), IL-8 (Me=6,9, p=0,0036), IFN-γ (Me=4,9, p=0,013), IL-10 (Me=2,3, p=0,0023), а также СD45 (Me=2,6, p=0,015) по сравнению с контрольной группой, а уровень экспрессии IL-12α (Me=0,33, p=0,0055) и IL-18 (Me=0,15, p=0,000046) был достоверно ниже, чем в контроле.
Различий по уровню экспрессии TGF-β1 между группами не отмечено.
При сравнении групп с ХРВК в виде моноинфекции и БВ (см.рис.2 на вклейке) было обнаружено, что при ХРВК уровень экспрессии мРНК IL-1β (p=0,032), TNF-α (p=0,0058) был достоверно выше, чем при БВ. А повышение уровня экспрессии гена IL-6 (в 4,4 раза) и LIF при БВ было более существенным, чем при ХРВК.
Учитывая широкое, зачастую неконтролируемое применение антибиотиков, следствием которого является нарушение нормального баланса микрофлоры урогенитального тракта, ВВК справедливо можно отнести к заболеваниям современной цивилизации. Предполагают, что клинические проявления ВВК обусловлены «чрезмерной агрессивностью врожденного иммунного ответа» [4], а диссеминация Candida spp. в организме сопровождается иммунорегуляторными изменениями в звене адаптивного иммунитета [2].
Важную роль в иммунном ответе при ВВК, помимо макрофагов и нейтрофилов, играют дендритные клетки (ДК). Полагают, что главным образом ДК способны поглощать пептидные фрагменты, переходить из периферической ткани в лимфатические узлы и запускать дифференцировку примитивных Th0-лимфоцитов по Th1-пути. Распознавание патогенов ДК осуществляется через рецепторы, которые взаимодействуют с соответствующими поверхностными молекулами на инфекционных агентах. Общие поверхностные повторяющиеся молекулярные структуры патогенов получили название патогенассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП), а соответствующие им распознающие рецепторы — паттернраспознающих рецепторов (ПРР) [8]. В качестве ПАМП у кандид выступают компоненты клеточной стенки: β-глюкан, маннопротеины и хитин [8]. За последние 10—15 лет были идентифицированы и изучены многочисленные ПРР: толл-лайк-рецепторы (ТЛР), нод-лайк-рецепторы, лектиновые рецепторы С-типа [5]. Важное значение в инициации иммунного ответа в отношении грибов имеют ТЛР-1, ТЛР-2, ТЛР-4, ТЛР-6, лектиновые рецепторы С-типа, такие как дектин-1, дектин-2; рецептор маннозы и др. [6].
На разных стадиях жизненного цикла (бластоспоры и гифы) кандид могут быть задействованы различные ТЛР. Бластоспоры активируют как ТЛР-2, так и ТЛР-4, гифы — только ТЛР-2 [11]. Взаимодействие манопротеинов кандид с ТЛР-4 стимулирует Th1-ответ через продукцию IL-12, IFN-γ, TNF-α и IFN 1-го типа [8], что в конечном счете приводит к эффективной ликвидации кандид. Напротив, связывание кандид с ТЛР-2 приводит к экспрессии TGF-β1 и IL-10, которые поддерживают иммуносупрессию и обеспечивают толерантность к антигенам кандид [11]. Однако при активации β-глюканом кандид ТЛР-2 в гетеродимере с дектином-1 запускается сигнальный каскад, который способствует синтезу провоспалительных цитокинов.
Таким образом, Candida albicans теоретически может вызывать несколько типов иммунного ответа. В этом случае цитокины будут отражать характер иммунного ответа: от толерантности к антигенам кандид до резко выраженной воспалительной реакции.
Рассматривая вопросы взаимодействия грибов с организмом хозяина, мы принимали во внимание, что ХРВК всегда протекает на определенном иммунологическом фоне, задаваемом персистирующими на слизистых оболочках микроорганизмами.
Известно, что в норме во влагалищной флоре доминируют лактобактерии [9]. Используя гликоген, вырабатываемый эпителиальными клетками хозяина, лактобактерии образуют молочную кислоту и перекись водорода, поддерживая кислую реакцию pH вагинального содержимого. При дисбиотических состояниях наблюдается резкое снижение уровня лактобактерий, вплоть до их полного исчезновения и замещения условно-патогенной флорой. Персистенция на слизистых урогенитального тракта Candida spp. может осуществляться как при кислых значениях pH, когда доминирующим морфотипом являются лактобактерии, так и в более щелочных условиях при БВ. Поэтому в работе учитывалось состояние микрофлоры вагинального отделяемого.
В комплексе с классическими клинико-лабораторными методами исследования (кольпоскопия, цитологическое, микробиологическое исследование и др.) был использован новый метод оценки биоценоза влагалища на основе ПЦР в режиме реального времени. Преимущество использования данного метода состоит в том, что он позволяет не только идентифицировать микроорганизмы, входящие в состав биоценоза влагалища, но и оценить процентное соотношение нормофлоры, условнопатогеных микроорганизмов и общей бактериальной массы.
Для оценки состояния локального иммунитета изучали экспрессию мРНК генов цитокинов. Часть из них — IL-1β, TNF-α, IL-8, LIF и СD45 — были выбраны как маркеры воспалительного процесса. Помимо этого, принимая во внимание участие Th1-лимфоцитов в защитных реакциях при кандидозе, целесообразно было определить такие регуляторные цитокины, как IFN-γ, IL-18, IL-12α/p35. IFN-γ продуцируется Th1-лимфоцитами и является наиболее сильным стимулятором макрофагов (микробоцидной активности, продукции цитокинов), повышает экспрессию МНСI и МНСII, а также молекул адгезии на эндотелиальных клетках, увеличивая проницаемость эндотелия. Он ограничивает размножение гриба на ранних стадиях кандидозной инфекции, стимулирует иммунный ответ [1]. При ХРВК в виде моноинфекции и при ХРВК в сочетании с БВ мы обнаружили достоверное повышение уровня данного цитокина в сравнении с таковым в контрольной группе. Очевидно, что повышение IFN-γ можно считать благоприятным маркером при ХРВК.
Важность IL-12 и IL-18 при кандидозе определяется их участием в дифференцировке CD4+-Тh0 в сторону Th1-типа [9], а следовательно, способностью стимулировать выработку INF-γ. Показано, что при экспериментальном кандидозе у мышей рекомбинантный IL-12 значительно повышает эффективность антифунгальной терапии [1]. Вместе с тем, вопреки ожидаемым результатам, в нашем исследовании было показано, что уровень эксрессии мРНК IL-12α и IL-18 (основных индукторов Th1-ответа) снижен. Возможно, что недостаточная стимуляция Th1-ответа и приводит к персистенции Candida spp.
IL-10 и TGF-β1 являются иммуносупрессорами. Полагают, что основными продуцентами данных цитокинов у человека являются Т-регуляторные клетки. Существует точка зрения, что диссеминация Candida spp. в организме и хронизация процесса сопровождаются иммунорегуляторными изменениями в звене адаптивного иммунитета, связанными с повышением IL-10 и TGF-β1 [2]. Наши исследования показали, что мРНК TGF-β1 присутствует в клетках вагинальных соскобов в большом количестве. Однако его содержание у пациенток с ХРВК не отличается от аналогично-го показателя в контрольной группе. А количество мРНК IL-10 и при ХРВК, и при БВ действительно достоверно выше, чем у пациенток контрольной группы, что согласуется с данными D.Lilic и соавт. [7] и P. Yasodhara и соавт. [12]. Описаны некоторые механизмы супрессорного действия С. albicans на иммунную систему хозяина. В частности, белок р43 гриба С. albicans обладает способностью стимулировать синтез противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 [11].
При ХРВК очень важен баланс провоспалительных и иммуносупрессорных цитокинов. Провоспалительные цитокины обеспечивают развитие и полноценное функционирование всех стадий иммунных реакций против Candida spp. Противовоспалительные цитокины сдерживают чрезмерную активность воспалительного процесса и не дают ему перейти в разряд патологических. При БВ уровень экспрессии мРНК IL-6 выше
в 4,4 раза, LIF — в 2 раза, а синтез IL-1β и TNF-α достоверно ниже, чем при ХРВК. Вероятно, что БВ не сопровождается такой активацией макрофагального звена иммунного ответа, как ХРВК.
Таким образом, при ХРВК как в виде моноинфекции, так и в сочетании с БВ повышается уровень экспрессии провоспалительных цитокинов: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ, а также СD45 по сравнению с контрольной группой. Полученные данные согласуются с теоретическими представлениями об активации макрофагального (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) и Th1-лимфоцитарного (IFN-γ) звеньев иммунного ответа. Повышение CD45 может быть связано с увеличением количества лейкоцитов во влагалищном отделяемом относительно клеток эпителия. Вместе с тем, вопреки ожидаемым результатам, снижены уровни IL-12α и IL-18 (основные индукторы Th1-ответа) и повышена экспрессия IL-10 (супрессор Th1-ответа). Таким образом, исходя из полученных результатов, можно полагать, что в развитии воспали-тельного процесса при ХРВК существенную роль играют следующие цитокины: IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-18, IL-12α/p35, IL-10, IFN-γ и CD45.
