Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) представляет собой одно из наиболее загадочных заболеваний репродуктивной системы и требует мультидисциплинарного подхода. Эта патология встречается у 1–2% женщин и проявляется вторичной гипергонадотропной аменореей в возрасте до 40 лет [20]. В настоящее время не разработаны критерии, на основании которых можно было бы прогнозировать развитие этой патологии. Гормональные и биохимические тесты не позволяют предсказать скорость ежемесячной потери фолликулов и установить истинный биологический возраст яичников [9]. Все выше представленное требует поиска новых адекватных молекулярно-биологических маркеров оценки скорости старения яичников, которые в ряде случаев позволят прогнозировать их преждевременное истощение.
В качестве причин ПНЯ в настоящее время рассматриваются различные молекулярно-генетические, а также эпигенетические (неслучайная инактивация Х хромосомы) изменения Х хромосомы. К ним относится также премутация в гене FMR1 (число CGG-повторов 54–200), которая долгое время относилась к ведущему фактору риска развития ПНЯ [5, 8, 19, 21]. В последние годы было показано, что нормальное число CGG-повторов, находящееся в пределах 26–34 (в среднем 30), косвенно позволяет судить о нормальной функции яичников и прогнозировать их своевременное выключение [6, 14]. В том случае, если число тринуклеотидных повторов ниже или выше этих значений, существует риск развития ПНЯ [12, 17].
Ранее нами было показано, что у 45% пациенток с ПНЯ на фоне выключенной функции яичников
число CGG-повторов в гене FMR1 соответствовало нормальному диапазону, что, по-видимому, исключает молекулярно-генетические нарушения как ведущую причину преждевременного истощения у них примордиального пула [4]. Все вышеизложенное явилось основанием для углубленного клинико-лабораторного обследования этой группы больных с целью уточнения генеза преждевременного старения яичников. Целью исследования явилось изучение связи длин CGG-повторов в гене FMR1 с генезом ПНЯ.
Материал и методы исследования
Были обследованы 78 пациенток с диагнозом ПНЯ, который был подтвержден на основании следующих клинико-лабораторных критериев. Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) составил 101,71±38,09 МЕ/л, лютеинизирующего гормона(ЛГ) – 59,35±39,82 МЕ/л, антимюллерового гормона (АМГ) – 0,2±0,03 нг/мл, концентрация эстрадиола (Е2) – 87,33±70,25 пмоль/л. По данным ультразвукового исследования, объемы яичников в среднем составили 2,52±1,92 см3 для правого яичника и 2,34±1,86 см3 – для левого.
Основной жалобой у всех больных было нарушение менструального цикла в виде вторичной аменореи и бесплодие (100%). «Приливы» жара отмечали 52 (66,6%) пациентки. На головные боли жаловались 15 (19,2%) пациенток, на повышенную утомляемость и снижение работоспособности – 37 (47,4%), на депрессию – 30 (38,5%), сухость во влагалище – 24 (30,8%) пациентки.
Дизайн исследования: одномоментное в параллельных группах. Группы формировались на основании выявления числа CGG-повторов в аллелях гена FMR1: аллель 1 – с мéньшим числом повторов, 2 – с бóльшим (согласно данным Y.H. Fu и N. Gleicher и соавт.) [14, 12]:
· группа А (аллель 1 <26 триплетных повторов) включала женщин с мéньшим числом CGG-
триплетов, n=24;
· группа В (аллель 1 ≥26 и аллель 2 ≤34) включала женщин с нормальным числом повторов, n=32;
· группа С (аллель 2 >34) состояла из женщин с бóльшим числом триплетных CGG-повторов, n=22.
Функциональное состояние гипоталамогипофизарно-надпочечниково-яичниковой и тиреоидной систем оценивали по результатам определения уровня гипофизарных (ФСГ, ЛГ, тиреотропного гормона – ТТГ), стероидных (Е2, тестостерона – Т, дегидроэпиандростерона – DHEA), АМГ и тиреоидных гормонов (свободного тироксина – Т4св). Эхографию органов малого таза осуществляли с использованием трансабдоминального и эндовагинального конвексных датчиков частотой 3,5, 5 и 7,5 Мгц.
Генетическое тестирование включало оценку наличия неслучайной инактивации Х-хромосомы и числа CGG нуклеотидных повторов в гене FMR1 и производилось в лаборатории молекулярной биологии человека на генетическом анализаторе АВI3100. Определение неслучайной инактивации Х-хромосомы (SXCI) при пороге 80% проводили с помощью метил чувствительного количественного флуоресцентного ПЦР (полимеразная цепная реакция) анализа CAG-повтора в 1 экзоне гена AR.
Исследование полиморфизма гена FMR1 включало определение числа CGG-повторов в 5’-нетранслирующемся районе 1 экзона гена.
Учитывая, что ПНЯ может быть одной из составляющих аутоиммунного полигландулярного синдрома, мы провели исследование яичниковых антител, а также уровней специфических аутоантител к другим органам (щитовидной железе) и неспецифических антител к фосфолипидам, к ядрам клеток и митохондриям. В литературе эта панель иммунологических тестов представлена как достаточная для определения аутоиммунных нарушений на субклиническом уровне [3, 11, 13].
Для определения антиовариальных аутоантител (АТовар.) использовали метод непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) и считали их положительными при показателе выше 10 Ед/мл. Антитела к антигенам щитовидной железы (АТ-ТГ и ТПО), антимитохондриальные, антинуклеарные и антифосфолипидные антитела определяли методом иммуноферментного анализа по стандартной методике.
Статистический анализ полученных данных выполнен на компьютере PC IBM (США) с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica 10. Непрерывные данные были проверены на нормальность (W-теста Шапиро–Уилка) и выражены в виде среднее±стандартное отклонение (M±SD). Статистическую значимость между средними данными в 2 группах оценивали при
помощи двухвыборочного t-теста, в 3 группах – при помощи теста Крускалла-Уоллиса, парное сравнение групп осуществлялось с помощью критерия Манна-Уитни. Категориальные данные были оценены при помощи χ2-теста, или точного критерия Фишера. Мерой ассоциации был выбран показатель относительного риска (ОР±95% доверительный интервал [ДИ]). Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования
Средний возраст больных в группе А составил 32,3±6,1 года, в группе В – 33,3±6,9 года, в группе С – 34,4±3,9 года (р>0,05), длительность вторичной аменореи составила от 7 мес до 13 лет и не отличалась статистически в трех группах пациенток (р>0,05). В среднем продолжительность заболевания к моменту обследования составила в группе А – 4,7±3,6 года, в группе В – 3,1±2,3 года, в группе С – 4,5±4,6 года (р>0,05) при среднем возрасте наступления аменореи – 27,9±7,1; 30,0±7,4 и 30,3±5,8 года в каждой группе соответственно (р>0,05). При изучении преморбидного фона была выявлена крайне высокая частота перенесенного паротита и краснухи в детстве (33,3; 46,9 и 27,3% – для паротита и 33,3; 40,6 и 40,9% – для краснухи в группах соответственно; р>0,05). Изучение семейного анамнеза показало, что часто у родственниц пациенток обнаруживались различные аутоиммунные заболевания (20,8, 21,8 и 9% в группах соответственно; р>0,05) (табл. 1).
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика групп пациенток.
Яичниковые антитела были положительными у 15 (19,2%) пациенток. В целом по выборке пациенток с ПНЯ и положительными АТовар. аутоиммунный тиреоидит был выявлен в 7 (46,66%) случаях, ревматоидный артрит – в 2 (13,33%) случаях и миастения у одной (6,66%) пациентки. Частота
выявления различных аутоиммунных антител у пациенток этой группы составила 66.6%.
У 63 пациенток без АТовар. в 8 (12,7%) случаях обнаружены антитиреоидные, у 1 (1,6%) – антинуклеарные антитела и в 2 (3,17%) случаях выявлена изолированная аутопатология неэндокринного генеза (ревматоидный артрит и миастения). Частота выявления различных аутоиммунных антител у пациенток этой группы составила 17,5%. Таким образом, ОР выявления сопутствующей аутоиммунной патологии у пациенток при наличии АТовар. по сравнению с пациентками, не имеющими их, составил 3,82 (95% ДИ 2,57–9,81; χ2=14,91, р=0,0001). В целом различные аутоиммунные антитела были выявлены у 26 (33,3%) из 78 больных ПНЯ.
Премутация гена FMR1 была обнаружена у 3 (3,8%) пациенток с ПНЯ, а неслучайная инактивация Х-ромосомы была обнаружена у 18 (23%) из 78 пациенток. Анализ особенностей клинического течения заболевания и результаты гормонального и молекулярно-генетического обследований в группах позволил предположить генез ПНЯ (табл. 2).
Таблица 2. Генез развития ПНЯ в изучаемых группах пациенток.
В группе А у 1 (4,16%) пациентки были выявлены положительные АТовар., у 1 (4,16%) – сопутствующая аутоиммунная патология (аутоиммунный тиреоидит), у 8 (33,3%) – неслучайная инактивация Х-хромосомы, у остальных (58,38%) причина развития заболевания, по-видимому, была обусловлена только коротким числом CGG-повторов в гене FMR1.
В группе В с нормальной длиной CGG-повторов различные органоспецифические и неспецифические проявления аутоиммунного процесса были выявлены у 23 пациенток, что составило 71,8%: у 13 (40,6%) пациенток были выявлены АТовар.; у 1 (3,12%) – антинуклеарные антитела; у 2 (6,25%) – изолированная неэндокринная форма аутоиммунной патологии (ревматоидный артрит и миастения); у 9 (28,12%) – сопутствующая аутоиммунная патология эндокринного и неэндокринного генеза. При этом клиническая форма аутоиммунного тиреоидита была диагностирована у 3 (9,37%) пациенток, субклиническая – у 4 (12,5%) пациенток, из которых 1 пациентка одновременно страдала аутоиммунной патологией неэндокринного генеза (витилиго). У оставшихся 9 (28,2%) больных из группы В в 6 (18,75%) случаях была обнаружена неслучайная инактивация Х-хромосомы, а в 3 (9,3%) случаях генез заболевания выявить не удалось.
В группе С с числом CGG-повторов более 34 во второй аллели у 1 (4,54%) были положительные АТовар., у 4 (18,18%) выявлена неслучайная инактивация Х-хромосомы. У остальных (67,28%) причина развития заболевания, по-видимому, обусловлена только длинным числом CGG-повторов в гене FMR1.
Сравнительный межгрупповой анализ показал, что аутоиммунный генез ПНЯ статистически
значимо чаще встречался у женщин с нормальными длинами CGG-повторов по сравнению с пациентками с мéньшим и бóльшим числом повторов (71,8% в группе В, 8,32% в группе А и 4,54% в
группе С; р=0,002), доля пациенток с нормальной длиной повторов в группе с аутоиммунным генезом составила 88,4% (23/26). Для больных ПНЯ аутоиммунного генеза характерно статистически значимое мéньшее число CGG-повторов во второй аллели (32,8±3,3 против 35,6±6,69; р=0,03).
На основании всего выше представленного можно сделать вывод, что наличие нормальной длины повторов во второй аллели у больных ПНЯ может указывать на наличие аутоиммунной формы ПНЯ, т.к. в ее развитии в бóльшей степени задействованы не молекулярно-генетические причины, а аутоиммунные детерминанты. В то же время бóльшее или мéньшее число CGG-повторов может являться ранним прогностическим критерием формирования молекулярно-генетической формы ПНЯ. Высказанная нами гипотеза подтверждается двукратным увеличением частоты представленности неслучайной инактивации Х-хромосомы у пациентокносительниц бóльшего и мéньшего числа CGG-
повторов (51,5% в группах А и С против 18,75% в группе В; р=0,4494). Однако эти различия не
были статистически значимыми.
При проведении сравнительного анализа (табл. 3) гормональных показателей было установлено, что у 26 пациенток с аутоиммунным генезом ПНЯ уровень АМГ в среднем составил 0,13±0,03 нг/мл по сравнению с 0,06±0,01 нг/мл (р<0,05) у пациенток с другими причинами заболевания, что указывает на некоторую сохранность примордиального пула при аутоиммунных
поражениях.
Таблица 3. Сравнительная характеристика пациенток с аутоиммунным и иным генезом развития ПНЯ.
Таким образом, группа А представлена в основном больными ПНЯ молекулярно-генетического (58,38%) и эпигенетического (33,3%) генеза; группа С – в основном пациентками с молекулярно-генетическими (67,28%) и эпигенетическими (18,18%) причинами развития заболевания с превалированием молекулярно-генетических нарушений. Разница по представленности эпигенетических причин в группах А и С не была статистически значимой (р=0,55).
Обсуждение
ПНЯ охватывает гетерогенный спектр состояний, включающий помимо широко представленных молекулярно-генетических нарушений на Х-хромосоме, также и аутоиммунные поражения [7, 10, 11].
Проведенные гормональные обследования свидетельствуют о развернутой клинической форме заболевания наших пациенток, на что указывают высокие уровни ФСГ, ЛГ и низкие уровни Е2 и АМГ.
Анализ становления менструального цикла у этой категории больных, его продолжительность
не позволяет нам выявить какие-либо особенности, которые бы в пубертатном и юношеском
возрасте настораживали пациенток в отношении возможного повышенного риска возникновения
в дальнейшем преждевременного выключения функции яичников.
Пусковым механизмом развития аутоиммунного процесса в ткани яичников являются внешние антигены (вирусы или бактерии), собственные яичниковые антигены, формирующиеся под воздействием аутотоксинов. Наиболее часто среди вирусных антигенов патологическое воздействие на яичник оказывают вирусы паротита и краснухи [2]. По данным З.Г. Габибуллаевой (2008) относительный риск развития ПНЯ у пациенток, перенесших эпидемический паротит, составляет 2,88, а для тех, кто болел краснухой – 2,82 [1]. Изучение преморбидного фона наших пациенток выявило высокий инфекционный индекс, при этом эпидемический паротит перенесли 47,5%, краснуху 49% по сравнению с популяционными данными –32,3 и 12,6% соответственно (р<0,05).
По данным Fenishel и соавт., до 30% случаев ПНЯ рассматриваются как результат аутоиммунных нарушений [10]. Согласно многочисленным исследованиям, яичниковые антитела обнаруживали в 30–60% случаев при спорадических формах ПНЯ [10]. Проведенное нами исследование также подтвердило высокую частоту представленности аутоиммунной патологии у пациенток с ПНЯ – 33,3%, при этом АТовар. были обнаружены в 19,2% случаев. Опираясь на мнение P. Fenishel [10], в настоящее время выделяют 3 патогенетических варианта формирования ПНЯ. Согласно проведенным исследованиям Г.В. Тагиевой (2005), наиболее часто ПНЯ развивается в рамках 2-го клинического
варианта, который характеризуется наличием яичниковых антител в ассоциации с аутоиммунной полиэндокринопатией в сочетании с определенными генотипами HLA II класса (DRB1-04, DRB1-03) [2].
«Большими» диагностическими критериями, подтверждающими аутоиммунный генез ПНЯ считают сочетание гипергонадотропного гипогонадизма (ФСГ ≥40 МЕ/л, E2 ≤80 пмоль/л), уменьшение объема яичников до 2 см3 и менее, присутствие аутоантител к антигенам яичников в диагностически значимых титрах [2]. Согласно этим критериям, в нашем исследовании аутоиммунная патология выявлена в 19,2 % случаев. Однако на основании мнения Gleicher и Tsigkou с соавт., независимым фактором риска формирования аутоиммунной формы ПНЯ является также и «аутоиммунный шум», определяемый
на основании иммунологического скрининга, включающего наличие не только специфических, но и неспецифических аутоантител и иммунного клеточного ответа [13, 18]. Признаки «аутоиммунного шума» были выявлены нами у 14,1% больных, таким образом, те или иные аутоиммунные нарушения были подтверждены у 33,3%.
По данным литературы, преждевременное истощение фолликулярного пула генетически предопределено трансляцией мРНК и белка гена FMR1 и зависит от числа триплетных CGG последовательностей в нем [12, 14]. Gleicher и соавт. показали, что как увеличение, так и укорочение длины CGG-повторов в гене FMR1 относительно нормы указывает на риск развития ПНЯ [14]. Нами у больных с ПНЯ в 59% случаев выявлена бóльшая либо мéньшая длина CGGповторов, а в 41% – число тринуклеотидных повторов соответствовало норме, что позволяет предположить наличие негенетической причины развития преждевременного истощения примордиального пула.
Мы показали, что выявление нормального диапазона длин CGG-повторов в гене FMR1 у больных ПНЯ сочетается в основном с полигландулярной аутоиммунной патологией, при этом в 71,8% случаев выявляется аутоиммунное поражение ткани яичников, в 18,7% случаев – неслучайная инактивация Х-хромосомы как эпигенетическая причина. Учитывая, что аутоиммунная форма ПНЯ может быть обусловлена внешним вмешивающимся фактором (перенесенной вирусной инфекцией), нормальная длина CGG-повторов в гене FMR1 у этих больных вполне объяснима.
Согласно полученным нами результатам, женщин с ПНЯ можно разделить на две разные группы: женщин с аутоиммунными нарушениями, имеющими относительно более легкую степень старения яичников, что подтверждается более высоким, хотя все же патологически низким (0,13±0,03 нг/мл) уровнем АМГ и нормальным числом CGG-повторов; и женщин без аутоиммунных нарушений с низким уровнем АМГ (0,06±0,01 нг/мл) и бóльшим или мéньшим числом CGG-повторов в гене FMR1. Аутоиммунные нарушения часто остаются нераспознанными и не принимаются во внимание в качестве причины женского бесплодия. Тем не менее субклинические и клинические проявления патологии
щитовидной железы выявлены нами в 26% случаев. По данным З.Г. Габибуллаевой (2008), ОР развития ПНЯ у лиц с аутоиммунной патологией щитовидной железы составляет 3,6 [1].
Любые попытки как можно раньше диагностировать раннюю стадию преждевременного старения яичников позволят снизить долю внезапно наступившей яичниковой аменореи и ускорить соответствующие клинические вмешательства.
Инициация яичниковой недостаточности начинается со снижения фертильности на фоне еще регулярных менструаций и физиологических концентраций ФСГ в крови. Эта стадия расценивается как «скрытая». Далее развивается «биохимическая» стадия, характеризующаяся помимо снижения фертильности персистирующим увеличением базальных уровней ФСГ, однако ритм менструаций еще остается регулярным. На финальной, или «явной», стадии к данным симптомам присоединяется нерегулярный ритм менструаций или наступает вторичная гипергонадотропная аменорея [16]. Не вызывает сомнений, что больные, обращающиеся к гинекологу с жалобами на вторичную аменорею, уже находятся в заключительной фазе яичниковой недостаточности.
С нашей точки зрения, на скрытой стадии яичниковой недостаточности в дополнение к общепризнанным методам исследования [15] необходимо рекомендовать обследование, включающее
определение длины CGG-повторов в гене FMR1 как раннего предиктора диагностики молекулярно-генетической формы ПНЯ. Анализ причин снижения фертильности, основанный на определении числа CGG-повторов и наличия аутоиммунных нарушений, включая и признаки «аутоиммунного шума», может помочь в доклинической диагностике ПНЯ и позволит женщине спланировать деторождение или принять меры для сохранения фертильности (криоконсервация ооцитов, овариальной ткани или эмбрионов).
