Решающие успехи молекулярной биологии за последние несколько лет в расшифровке тонкой структурно-функциональной организации генома человека, картировании на хромосомах многих структурных генов привели к значительному прогрессу в области медицинской генетики, существенно расширили и обогатили наши знания о молекулярной природе наследственных заболеваний, способах их точной диагностики и профилактики. Одним из наиболее ярких событий в молекулярной генетике за минувшее десятилетие явилось открытие принципиально нового типа мутаций — экспансии (увеличения) числа копий внутригенных тринуклеотидных повторов, приводящей к появлению наследственных заболеваний человека. Такой класс мутаций, связанный с нестабильностью данных повторов, называют динамическими мутациями.
Y.H. Fu и соавт. в 1991 г. выявили, что для каждой третьей женщины характерен числовой диапазон в пределах 29–30 CGG-повторов в гене FMR1, который он предложил считать условной нормой [11]. В дальнейшем в работах L.S. Chen [7] и N. Gleicher и соавт. [14, 17] было показано, что для фертильных женщин с нормальным овариальным резервом характерно именно это количество повторов.
Welt и соавт. в 2004 г. cообщили, что у больных с увеличением длины CGG-повторов в гене FMR1, вплоть до премутации гена (50–200 CGG-повторов), отмечается статистически значимое повышение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), снижение уровней ингибина А и В, не соответствующих их возрастной норме. Таким образом, ими было предложено использовать аномальную длину CGG-повторов в качестве прогностического критерия развития преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ), что было подтверждено временем наступления менопаузы, на 5 лет опережающим возраст их сверстниц — носительниц условной нормы CGG- повторов в гене FMR1 [26].
Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности изучения представленности разного числа СGG-повторов у пациенток с ПНЯ и их связи с уровнем антимюллерова гормона (АМГ), что и явилось целью настоящего исследования.
Материал и методы исследования
Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы 100 пациенток с ПНЯ оценивали по результатам определения уровня гипофизарных (лютеинизирующий гормон — ЛГ, ФСГ) и яичниковых (эстрадиол) гормонов. Для оценки овариального резерва у 72 из них определяли уровень АМГ в плазме крови. Концентрацию гормонов исследовали методом иммуноферментного или радиоиммунного анализа с помощью соответствующих тест-систем на автоматическом анализаторе Cobar Core II. Для определения аллелей CGG-повтора в гене FMR1 использовали метод метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР) на генетическом анализаторе АВI3100 в соответствии с протоколом фирмы Applied Biosystems. Результаты представляли в виде графического изображения сигналов маркера и исследуемых фрагментов гена FMR1 и таблицы с параметрами пиков и длинами фрагментов ДНК.
В зависимости от числа CGG-повторов в алле-лях (аллель 1 с меньшим числом повторов, 2 — с большим) пациентки были разделены на 3 группы: группа А (аллель 1<26 триплетных повторов) включала женщин с патологически коротким числом CGG-триплетов. Группа В (аллель 1≥26 и аллель 2 ≤34) представляла лиц с нормальным числом повторов [11]. Группа С (аллель 2>34) состояла из женщин с длинным числом триплетных CGG-повторов, которые, согласно данным литературы, должны ассоциироваться с повышенным риском развития преждевременного старения яичников [6–8].
Для оценки возможной статистической связи между коротким (<26) в аллели 1 и длинным числом повторов в аллели 2 (>34) и параметрами овариальной функции (ФСГ и АМГ) были построены модели линейной регрессии для групп А и С.
Вторым этапом работы было разделение этих же больных на 3 группы в зависимости от выявленной зиготности гена FMR1. В 1-ю группу вошли пациентки, у которых число CGG-повторов в гене FMR1 было в пределах нормальных значений а обеих аллелях (26-34), 2-я группа была представлена гетерозиготными носителями аномального числа повторов, т.е. одна аллель в пределах нормального диапазона, а вторая, выходящая за эти пределы, 3-я группа состояла из женщин, имеющих оба аллеля вне зоны нормального диапазона CGG-повторов (26>CGG>34).
Статистический анализ полученных данных выполнен на компьютере PC IBM (США) с помощью электронных таблиц Microsoft Excel, пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc. (США), пакета SPSS (версия 10.0.7). Результаты исследования представлены как среднее±стандартное отклонение (M±SD). С помощью W-теста Шапиро–Уилка показатели были проверены на нормальное распределение.
Определение достоверности различий между сравниваемыми группами осуществлялось с помощью двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями, метода Колмогорова–Смирнова, Манна–Уитни, а также определения критерия Стьюдента для оценки разности выборочных долей. Порядковые данные были оценены на основе метода χ2 или точного критерия Фишера. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Зависимость между показателями определяли с помощью корреляционного анализа Пирсона или Спирмена.
Все пациентки, принявшие участие в исследовании, подписали информированное согласие во время первичного осмотра.
Результаты исследованияи обсуждение
Пациентки, включенные в исследование, страдали вторичной аменореей. Средний возраст женщин составил 31,46±4,4 года, возраст дебюта заболевания — в среднем 28,6±8,1 года, продолжительность заболевания — 4,27 ±1,01 года, в то время как полное прекращение функции яичников отмечено в среднем в 29,64±7,1 года. Средний уровень ФСГ по группам составил 105,7±1,01 МЕ/мл, средний уровень ЛГ — 64,3±41,3 МЕ/мл. Уровень эстрадиола по группам в среднем составил 75,9±54,2 пг/мл. Концентрация АМГ не превышала 0,5 пг/мл. При исследовании числа копий CGG-повторов в гене FMR1 у 100 больных с ПНЯ только в 3 (2,9%) случаях выявлено более 50 CGG-повторов, что соответствует премутационной зоне гена FMR1 (от 50 до200 повторов). Одна из этих больных страдала семейной формой ПНЯ, у двух других носительниц премутации гена FMR1 выявлена спорадическая форма заболевания. При семейных случаях ПНЯ (25/100 женщин) премутация гена FMR1 выявлена у 4% (1/25) больных, при спорадических — у 2,6% (2/76) Увеличение числа повторов в пределах «серой зоны» (от 41 до 50) выявлено у 9 (8,9%) из 100 больных.
В группу А (аллель 1 <26 повторов) были включены 34 пациентки (34%), в группу В (аллель 1≥26 повторов, аллель 2≤34 повторов) — 45 женщин (45%) и в группу С (аллель 2>34 повторов) – 21 женщина ( 21%) (рис. 1).
Как и ожидалось, у пациенток с ПНЯ [19, 21], несмотря на молодой возраст, концентрация ФСГ была значительно выше возрастной нормы во всех трех группах. При этом в группе С отмечено статистически достоверное повышение его уровня (122,31±37,86 МЕ/мл) в сравнении с группой А (105,88±34,34 МЕ/мл) и В (101,08±30,99 МЕ/мл), р<0,05. В группе В отмечено снижение уровня ЛГ (63,96±37,42 МЕ/мл) в сравнении с группой А (71,68±55,99 МЕ/мл) и С (73,55±40,14 МЕ/мл), р<0,05. Выявленные межгрупповые различия в уровнях гонадотропинов клинического значения не имеют [3]. Концентрация АМГ в группах А и С не превышала 0,2 пг/мл, таким образом, подтверждая наличие значительного снижения овариального резерва у достоверно большей части пациенток из этой когорты, однако в группе В отмечено статистически значимое повышение уровня АМГ (0,49±1,13 пг/мл) в сравнении с группой А (0,1±0,14 пг/мл) и С (0,09±0,15 пг/мл), p<0,05 (см. таблицу).
При проведении сравнительного анализа выявлена прямая умеренная корреляционная зависимость между числом CGG-повторов в гене FMR1 и уровнем АМГ в группе А (r=0,358, p<0,05). В то же время в группе С обнаружена обратная умеренная зависимость между числом повторов и уровнем АМГ (r=-0,3174, p<0,05). При этом в группе В (CGG-повторы в пределах нормы) зависимости между уровнем АМГ и числом повторов не выявлено (r=0,07, p>0,05) (рис. 2).
Таким образом, у больных с ПНЯ, несмотря на значительное снижение овариального резерва, в каждом втором случае число CGG-повторов в гене FMR1 находится в пределах условной нормы. В то же время при выявлении аномального числа CGG-повторов для этой категории больных более характерно снижение длины триплетных повторов, соответственно 34 против 21% (p<0,05).
На втором этапе обследования пациентки были распределены на 3 группы с учетом выявленной зиготности числа CGG-повторов в обеих аллелях гена FMR1. Группа больных с числом CGG-повторов 26–34 в обеих аллелях составила 45% от числа обследованных и расценивалась как нормальная. Группа больных с гетерозиготным носительством аномальных длин повторов гена FMR1 составила 40%, в то время как с гомозиготным носительством — 15%. Нами был проведен углубленный межгрупповой анализ у этих больных по основным клинико-лабораторным показателям. При этом не выявлено достоверных различий по возрасту менархе (соответственно 13,12±1,32; 15,59±1,4 и 13,59±1,22 года), по продолжительности менструаций до дебюта заболевания (15,08±8,6; 16,47±7,3 и 16,94±5,5 года), числу беременностей до дебюта заболевания (3,05±1,5; 2,28±1,8 и 1,4±0,9). Однако у гомозиготных по CGG-повторам больных в 25% случаев в сравнении с 13% у больных с нормальным числом CGG-повторов и 15% с гетерозиготным носительством с менархе наблюдалась олигоменорея. Различия между группами статистически достоверны (р<0,05). В группе больных с нормальным числом повторов не выявлено какой-либо зависимости между уровнем АМГ и возрастом пациенток. В группах с гомозиготным и гетерозиготным носительством аномальных длин СGG-повторов выявлена умеренная обратно пропорциональная зависимость между уровнем АМГ и возрастом (рис. 3).
Овариальный резерв определяет функциональное состояние репродуктивной системы женщины и снижается с увеличением возраста. Однако в последнее время появилось новое понятие — индивидуальный биологический возраст женщины, который по многим параметрам идентичен понятию овариального резерва [10]. Маркерами оценки овариального резерва являются возраст женщины, регулярность менструального цикла, уровни ФСГ, АМГ, объем яичников и число антральных фолликулов в них. АМГ отражает величину пула примордиальных фолликулов и не зависит от значений других параметров, являясь наиболее точным маркером состояния овариального резерва. У женщин с момента рождения до наступления менопаузы АМГ продуцируется гранулезными клетками яичников, при этом его экспрессия начинается от стадии первичных фолликулов вплоть до формирования больших антральных. Рост и начальные этапы созревания фолликулов, т.е. их качество, также связаны с продукцией этого представителя семейства трансформирующих факторов роста β, так как в этот период растущие фолликулы еще не находятся под гормональным контролем ФСГ [2]. Физиологическое старение яичников начинается с 27 лет. Возрастной диапазон с 28 до 37 лет характеризуется началом угасания репродуктивного потенциала, пик снижения которого приходится на 35–37 лет. Именно в этом возрастном периоде, согласно работе D. Nicolaou и соавт., в яичнике остается около 25 000 примордиальных фолликулов и скорость их элиминации увеличивается в 2 раза, что сопровождается резким снижением овариального резерва [22]. В исследованиях I.A. van Rooij и соавт. [25] показано, что уровень АМГ в плазме крови точно предсказывал наступление менопаузы в течение ближайших 4 лет, т.е. уровень АМГ может быть маркером овариального возраста, не всегда совпадающего с биологическим. Согласно данным литературы, у женщин в возрасте до 40 лет нормальный уровень АМГ зарегистрирован у 72% обследованных, и этот процент снижается до 13 в возрасте 41–44 лет [2]. Однако АМГ нельзя относить к долгосрочным прогностическим маркерам, так как этот показатель отражает состояние овариального резерва в ограниченном временном диапазоне.
Представленные выше данные явились основанием для поиска новых молекулярно-биологических маркеров, на основании которых можно было бы задолго до момента физиологического снижения овариального резерва предвидеть преждевременное истощение фолликулярного пула.
В многочисленных исследованиях ранее было показано, что у женщин, несущих одну X-хромосому с премутацией гена FMR1 (число CGG- повторов от 50 до 200), риск раннего прекращения менструаций выше [4,5,9]. G.S Conway и соавт. установили, что премутация гена FMR1 у женщин с ПНЯ встречается в 10 раз чаще, нежели в популяции. При обследовании 132 женщин с ПНЯ ими было обнаружено, что у 3 (13%) из 23 больных с наследственной формой ПНЯ и у 3 (3%) из 106 со спорадической формой ПНЯ выявлена премутация гена FMR1 в сравнении с ожидаемой частотой, составляющей 1:590 (р=0,02) [8].
Обобщенные данные литературы свидетельствуют о том, что у носительниц премутации гена FMR1 частота ПНЯ составляет от 13 до 26% [5, 9, 24]. В нашем исследовании при спорадической форме ПНЯ премутация выявлена в 2,6%, в то время как по данным C. Bussani и соавт. [6] и G.S. Conway и соавт. [8] — от 0,8 до 7,5%. При семейной форме, по нашим данным, она встречается в 4%, в то время как по данным литературы — в 13% случаев [8]. Казалось бы, с увеличением числа CGG-повторов частота выявления больных с ПНЯ должна возрастать, тем не менее эти отношения не линейны. Действительно, риск возникновения ПНЯ увеличивается при числе повторов от 59 до 99, после чего при числе повторов 100 и более наблюдается плато или уменьшение числа женщин, страдающих ПНЯ [8].
В 2008 г. представления об ассоциациях числа повторов в гене FMR1 и риска преждевременного старения яичников претерпели значительные изменения. N. Gleicher и соавт. в серии работ [12–19] было продемонстрировано, что практически любое изменение количества повторов вправо и влево от популяционного пика распределения (29–30 повторов) статистически достоверно коррелирует (p<0,002, p<0,001) с повышенным риском развития преждевременного снижения овариального резерва. В этой работе было показано, что при каждом снижении на 5 CGG-повторов ниже 30 относительный риск преждевременного снижения уровня АМГ возрастает на 60% (p<0,002), а для каждого повышения на 5 CGG-повторов – возрастает на 40% (p<0,001) [14]. Полученные нами результаты совпадают с данными литературы [20]. Мы выявили также, что как снижение, так и увеличение длины CGG-повторов у пациенток с ПНЯ приводит к снижению уровня АМГ. Однако для больных с ПНЯ в большей степени характерно снижение CGG-повторов, так как группа больных с аномально короткими повторами включала 34% обследуемых в сравнении с 21% женщин- носительниц длинных повторов. Таким образом, предлагаемый N. Gleicher и соавт. молекулярно-генетический маркер, основанный на определении аномальных длин CGG-повторов, безусловно, имеет диагностическую ценность, однако, учитывая, что у каждой второй больной этот показатель находится в пределах условной нормы, его нельзя считать тестом со 100% чувствительностью и диагностической значимостью. Наряду с этим в марте 2008 г. акушерами и гинекологами ведущих университетов мира были разработаны показания для тестирования с помощью определения CGG-повторов в гене FMR1. В группу риска были включены женщины с подозрением на преждевременную недостаточность яичников, включая ее скрытые и биохимические варианты, а также пациентки с бедным овариальным ответом в программе ЭКО и неясным генезом эндокринного бесплодия. Проводя тестирование, необходимо помнить, что выявление аномального числа CGG-повторов в гене FMR1 не является основанием для постановки диагноза. Этот биомолекулярный маркер в большей степени указывает на риск развития заболевания. После выявления риска снижения овариального резерва этой группе больных необходимо проводить долговременный, ежегодный мониторинг с использованием более дешевого и широко распространенного диагностического гормонального теста, основанного на определении уровня АМГ. У больных с условной нормой CGG-повторов в данной работе нами выявлены достоверно значимо более высокие концентрации АМГ (0,49±1,13 против 0,1±0,14 и 0,09±0,15 пг/мл; p<0,05), свидетельствующие о сохранности определенного числа примордиальных фолликулов. Таким образом, эта группа больных перспективна в плане возможного наступления спонтанной или стимулированной беременности. Согласно данным Н.Г. Мишиевой [2], уровни АМГ в пределах от 0,9 до 0,1 пг/мл свидетельствуют об умеренном снижении овариального резерва.
Полученные нами на первом этапе исследования результаты основаны на анализе одного аллеля гена FMR1 и, следовательно, не могут быть экстраполированы на гетерозигот (с одним аллелем в аномальном диапазоне) или гомозигот (оба аллеля в аномальном диапазоне). Мы провели работу, посвященную оценке связи ПНЯ с гетеро- и гомозиготностью в CGG-повторах, что позволило нам классифицировать больных с учетом их статуса по гену FMR1. Нами было показано, что при ПНЯ у 45% пациенток число CGG-повторов в обеих аллелях находится в пределах нормы. Выявлено примерно такое же количество (40%) гетерозиготных носительниц и значительно меньше (15%) — гомозиготных носительниц аномальной длины CGG-повторов. Достаточно редкая представленность двух патологических аллелей в гене FMR1 предсказуема, так как у больных с ПНЯ до дебюта заболевания в среднем в течение около 15 лет сохранялся самостоятельный менструальный цикл. Однако в группе с гомозиготным носительством аномальной длины CGG-повторов в каждом четвертом случае с менархе отмечалась олигоменорея. Факт наличия олигоменореи, по мнению З.Г. Габибуллаевой, относится к значимому прогностическому критерию (RR=3,6) [1] .
Согласно данным N. Gleicher и соавт., при обследовании доноров яйцеклеток и пациенток с бесплодием неясного генеза было показано, что при нормальном числе повторов определялся лучший овариальный резерв по сравнению с гетерозиготными носительницами в молодом возрасте, при гомозиготном носительстве отмечен самый низкий запас примордиальных фолликулов. При этом доказано, что расходование овариального резерва у пациенток с нормальным числом CGG-повторов в гене FMR1 происходит активнее по сравнению с гетеро- и гомозиготными носительницами и к возрасту 33–34 лет овариальный резерв у носительниц аномального числа повторов начинает превышать таковой у женщин с нормальным статусом по гену FMR1. На основе этих данных N. Gleicher высказал гипотезу о том, что, возможно, ген FMR1 является регулятором рекрутирования фолликулов из примордиального пула. Фактом экономного расходования примордиального пула у носительниц аномального числа CGG-повторов можно объяснить отсутствие каких-либо статистических различий в частоте наступления беременностей до дебюта заболевания по группам у наших больных.
В нашем исследовании в группе с нормальным числом повторов не было выявлено какой-либо зависимости между уровнем АМГ и возрастом пациенток. Отсутствие физиологического соотношения между уровнем АМГ и возрастом у носительниц нормального числа CGG-повторов в гене FMR1 свидетельствует о неких неизвестных нам нарушениях физиологических внутрияичниковых сигналов, скорее всего не генетического происхождения. В группах с гомозиготным и гетерозиготным носительством аномальных длин СGG-повторов выявлена умеренная обратно пропорциональная зависимость между уровнем АМГ и возрастом.
Таким образом, длина CGG-повторов в гене FMR1, безусловно, может быть одним из ранних объективных предикторов, указывающих на риск развития ПНЯ, и служить новым тестом для прогнозирования функциональной активности яичников. У молодых женщин с пороговыми для их возраста концентрациями ФСГ и/или АМГ патологически высокое или низкое количество CGG-повторов может в дальнейшем подтвердить предполагаемый диагноз снижения овариального резерва. Тестирование CGG-области гена FMR1 у пациенток с ПНЯ и другими формами патологии яичников важно как с теоретической точки зрения — для раскрытия тонких молекулярно-генетических механизмов патологического процесса, так и для практического здравоохранения — ранней диагностики заболевания у пациенток с высоким риском развития этой патологии [23]. Кроме того, важно помнить, что ген FMR1 является одной из потенциальных этиологических причин развития преждевременной недостаточности или старения яичника. В настоящее время описаны многочисленные молекулярно-генетические поломки, выявленные в разных локусах как короткого, так и длинного плеча Х-хромосомы, а также различные аутосомные нарушения, сопряженные с преждевременной недостаточностью яичников.
