В современном мире бесплодие является довольно распространенной проблемой и затрагивает примерно 15% всех пар репродуктивного возраста. Среди всех доступных методов лечения бесплодия вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) имеют самые высокие показатели наступления беременности и рождения живых детей. Стимуляция овуляции при проведении программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) проводится с целью получения большого количества ооцитов, для того чтобы снизить риск неудачи ЭКО путем выбора наиболее приемлемого эмбриона для переноса [1]. Выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом является одним из ведущих факторов успешного лечения бесплодия при использовании ВРТ [2]. В настоящее время оценка эмбрионов в основном основывается на морфологических критериях и скорости дробления клеток. Однако точность такого метода отбора эмбрионов остается недостаточно высокой, хотя его использование и привело к значительному повышению результативности программ ЭКО [3]. Именно поэтому во многих центрах репродукции осуществляется перенос 2 эмбрионов для повышения шансов наступления беременности в данном цикле. Но это существенно повышает риск развития многоплодной беременности, что, в свою очередь, приводит к повышению риска преждевременных родов и развитию сопутствующих осложнений [3]. Таким образом, развитие точных и неинвазивных объективных методов оценки качественных ооцитов и жизнеспособных эмбрионов является одной из наиболее важных целей репродуктивной медицины.
Современные представления о роли кумулюсных клеток в фолликулогенезе и оогенезе
В течение своего развития фолликулы подвергаются различным изменениям, включающим созревание, овуляцию, образование желтого тела и атрезию. Все эти процессы контролируются вырабатываемыми гипофизом гонадотропинами, которые оказывают непосредственное влияние на развитие ооцита и окружающие его соматические клетки [4]. В фолликуле выделяют два типа соматических клеток: муральная гранулеза, выстилающая полость фолликула и ответственная за стероидогенез, и кумулюсные клетки, непосредственно окружающие ооцит. Эти клетки имеют общее происхождение на ранних стадиях фолликулярного развития, однако на более поздних этапах, при формировании полости внутри фолликула, происходит дифференцировка клеток на 2 различных анатомических и функциональных слоя [5, 6]. В конечном итоге формируется зрелый ооцит-кумулюсный комплекс, в котором кумулюсные клетки остаются тесно связаны с ооцитом посредством специальных щелевых контактов, позволяющих осуществлять метаболический обмен и транспорт сигнальных молекул [7, 8]. Ооцит, в свою очередь, продуцирует растворимые факторы роста (ооцит-секретируемые факторы (OSF)), необходимые для роста окружающих фолликулярных клеток на разных этапах развития. Эти факторы роста регулируют широкий спектр функций гранулезных и кумулюсных клеток, включающий дифференцировку, пролиферацию, апоптоз и лютеинизацию [5].
Экспансия – важный процесс финальной стадии фолликулогенеза, характеризующийся ростом кумулюсных клеток с одновременной потерей тесных контактов между клетками. В процессе экспансии кумулюсные клетки продуцируют гиалуроновую кислоту, которая откладывается на экстрацеллюлярном матриксе, связывающем вместе ооцит и кумулюсные клетки. Эта уникальная способность клеток кумулюса подвергаться экспансии необходима для нормального развития ооцита и овуляции [9].
Таким образом, для нормального созревания фолликула необходима тесная взаимосвязь между ооцитом и окружающими его соматическими клетками. Именно важная роль кумулюсных клеток заставила ученых сосредоточиться на их исследовании. Клетки кумулюса, отделенные от ооцита для дальнейшего исследования, однородны, не содержат примесей других клеток, в то время как отделенные для анализа гранулезные клетки, как правило, содержат клетки крови и текальные клетки, что связано с методами, которые используются для их получения [10].
Исследование клеток кумулюса поможет идентифицировать потенциальные биомаркеры для оценки качества и репродуктивного потенциала ооцитов, дальнейшего развития эмбрионов и результатов программ ВРТ.
Анализ транскриптома кумулюсных клеток
Поиск новых подходов для оценки качества эмбрионов привел к развитию современных методов анализа транскриптомных профилей, позволяющих быстро и точно оценивать уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках. Исследования последних лет доказывают, что уровень экспрессии потенциально значимых генов в кумулюсных клетках коррелирует с показателями качества ооцитов [11–15], развитием эмбрионов [11, 13, 15–18], частотой наступления беременности [13, 16, 18–22] и рождения живых детей [21, 23, 24].
Влияние экспрессии генов на качество ооцитов и развитие эмбрионов
В своем первом исследовании McKenzie и соавт. показали наличие корреляции между уровнем экспрессии генов гиалуронан синтетазы 2 (HAS2), простагландин синтетазы 2 (PTGS2) и гена гремлин (GREM1) и показателями зрелости ооцитов, качеством эмбрионов и показателями оплодотворения [15]. Используя метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), они оценивали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках 108 ооцитов и доказали, что уровень экспрессии генов PTGS2 и HAS2 был в 6 раз выше, а уровень экспрессии GREM1 в 15 раз выше в кумулюсных клетках ооцитов, развившихся до эмбрионов высокого качества на 3-и сутки по сравнению эмбрионами низкого качества. Последующие исследования подтвердили взаимосвязь экспрессии гена GREM1 и показателей качества эмбрионов на 3-и сутки развития [11,16].
Feuerstein и соавт. сфокусировали свое внимание на оценке генов, экспрессирующихся кумулюсными клетками в ответ на выброс ЛГ: белка острого стероидогенного ответа (STAR), простагландин синтетазы 2 (PTGS2), амфирегулина (AREG), двух генов ацетил-CoA-десатуразы (SCD1 и SCD5) и коннексина 43 (Cx43) [12]. Экспрессия всех этих генов, за исключением Cx43, повышалась после возобновления мейоза. Таким образом, была выявлена взаимосвязь между повышением уровня экспрессии генов STAR, PTGS2, AREG,SCD1 и SCD5 и созреванием ооцита.
Zhang и соавт. сравнивали кумулюсные клетки ооцитов, из которых развились 8-клеточные эмбрионы на 3-й день развития, с ооцитами, у которых оплодотворения вообще не наступило. С помощью анализа на микроматрицах или микрочипах авторы выявили 160 генов с различным уровнем экспрессии в данных группах [14]. Последующая проверка с помощью метода ПЦР-РВ подтвердила наличие взаимосвязи между уровнем экспрессии гена PTX3 и развитием ооцитов. Однако, эти результаты противоречили данным исследования Cillo и соавт., продемонстрировавшим отсутствие корреляции между уровнем экспрессии генов в кумулюсных клетках ооцитов, развившихся до эмбрионов высокого качества на 3-й день развития, по сравнению с ооцитами низкого качества или отсутствием оплодотворения вовсе [11]. Подобным образом, используя метод ПЦР-РВ, Anderson и соавт. [16] также не выявили корреляции между уровнем экспрессии гена PTX3 в кумулюсных клетках, развитием эмбрионов и частотой наступления беременности.
Van Montfoort и соавт. исследовали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках 8 ооцитов с последующим ранним дроблением эмбрионов и 8 ооцитов с отсутствием раннего дробления эмбрионов [17]. Результаты данного исследования выявили 7 наиболее значимых генов, связанных с регуляцией клеточного цикла и участвующих в процессах ангиогенеза и апоптоза. В дальнейшем эти результаты были подтверждены методом ПЦР-РВ. Изменение экспрессии данных генов у эмбрионов с отсутствием раннего дробления свидетельствовало о наличии гипоксического состояния и задержке развития.
В 2011 году Wathlet и соавт. [18] провели анализ кумулюсных клеток у пациенток, проходящих программу ЭКО/ИКСИ с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ) и рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (рФСГ), в сравнении с пациентками, проходящими программу ЭКО/ИКСИ с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) и человеческим менопаузальным гонадотропином (ЧМГ). В исследовании оценивалось наличие корреляции между уровнями экспрессии 8 различных генов и показателями качества эмбрионов в различных протоколах стимуляции суперовуляции. Wathlet и соавт. обнаружили, что уровень экспрессии PTGS был выше, а VCAN ниже в зрелых ооцитах, находящихся в блоке метафазы второго мейотического деления (MII). Все гены, за исключением VCAN, положительно коррелировали с морфологическими показателями оценки качества эмбрионов на 3-и и на 5-е сутки развития, и были использованы для создания прогностической модели развития эмбрионов для протоколов стимуляции с антГнРГ и аГнРГ.
В дальнейшем Feuerstein и соавт. [13] в своем исследовании определяли уровень экспрессии 308 различных генов в 197 образцах кумулюсных клеток от 106 пациенток, проходивших программу ЭКО/ИКСИ. Они оценили наличие корреляции между уровнем экспрессии генов в кумулюсных клетках и показателями качества ооцитов и дальнейшего развития бластоцист. В дальнейшем авторами проводился мета-анализ уже имеющихся литературных данных для выявления наиболее значимых генов. В итоге из 308 генов 8 генов, коррелировавших с показателями качества ооцитов и развития эмбрионов по данным анализа на микроматрицах или микрочипах, были отобраны для дальнейшего подтверждения методом ПЦР-РВ. В результате только один ген – регулятор сигнальных путей G-белков (RGS2) подтвердил свою связь с показателями качества ооцитов и частотой наступления беременности.
Влияние экспрессии генов на частоту наступления беременности и показатели рождаемости
Используя показатель наступления беременности как главный измеряемый параметр в исследовании, Assou и соавт. с помощью анализа на микроматрицах или микрочипах оценили уровень экспрессии 630 различных генов в кумулюсных клетках [19]. Большинство этих генов имело высокий уровень экспрессии в группе забеременевших женщин, что доказывает наличие связи этих генов с развитием эмбрионов. Результаты исследования в дальнейшем были подтверждены методом ПЦР-РВ [19].
В дальнейших исследованиях Wathlet и соавт. проводили оценку экспрессии 11 генов у пациенток, проходящих программу ЭКО/ИКСИ с антГнРГ и рФСГ в сравнении с пациентками, проходящими программу ЭКО/ИКСИ с аГнРГ и ЧМГ. Не было обнаружено значительных различий в уровне экспрессии VCAN у женщин с наступившей беременностью по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила, в то время как прослеживалась четкая связь между экспрессией генов эфрина В2 (EFNB2), инозитол-трифосфат 3 киназы А (ITPKA) и кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы 1D (CAMK1D) и показателями наступления беременности [22]. Гены EFNB2, CAMK1D и станниокальцин-2 (STC2) использовались в предложенной модели для прогнозирования эффективности программы ВРТ.
По данным исследования Wathlet и соавт. [18], уровень экспрессии GREM1 был выше у женщин с наступившей беременностью при проведении программ ВРТ с антГнРГ по сравнению с аГнРГ. Однако Amderson и соавт. [16] не выявили значимой корреляции между показателями экспрессии GREM1, PTX3, HAS2 и частотой наступления беременности.
Более поздние исследования Gebhardt и соавт. показали, что уровень экспрессии генов версикан (VCAN) и PTGS2 был значительно выше в кумулюсных клетках ооцитов, перенос эмбрионов от которых привел к наступлению беременности и рождению живого ребенка [21].
Однако Papler и соавт., исследуя гены EFNB2, VCAN, CALM1, PTGS2 и ITPKA, не выявили никакой корреляции между уровнем экспрессии генов и показателями оплодотворения, имплантации [25] и наступления клинической беременности [20].
В 2013 году Iager и соавт. [23] в своем ретроспективном исследовании оценивали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках пациенток, проходивших программу ЭКО, в трех различных клиниках Китая и США. Анализ проводился методом ПЦР-РВ и анализа на микроматрицах или микрочипах с целью идентификации биомаркеров для прогнозирования рождения живых здоровых детей. Ученые оценивали уровень экспрессии 12 различных генов, коррелировавших с показателями живорождения и выявили, что данные гены могут использоваться в качестве маркеров для прогнозирования наступления беременности.
Корреляция между экспрессией генов в кумулюсных клетках и наличием анеуплоидий у плода
В 2012 году Fragouli и соавт. показали, что высокий уровень гена SPSB2 (супрессор цитокиновой сигнализации, содержащий SPRY-домен) в ооцитах коррелирует с показателями рождаемости живых здоровых детей [24]. Однако главной целью данного исследования являлось определение генов, уровень экспрессии которых коррелировал с наличием анеуплоидий у плода при проведении предимплантационной генетической диагностики. Ученые анализировали уровень экспрессии 96 генов, используя метод ПЦР-РВ, и обнаружили, что уровень экспрессии SPSB2 и опухолевого протеина (TP53I3) был значительно ниже в кумулюсных клетках ооцитов с хромосомными аномалиями. Эти результаты показывают, что оценка транскриптома кумулюсных клеток может стать новым альтернативным неинвазивным методом диагностики хромосомных аномалий у плода.
Заключение
Доказано, что взаимосвязь между ооцитом и окружающими его фолликулярными клетками является необходимой для нормального функционирования женской репродуктивной системы. Накопленные на сегодня данные подтверждают перспективность изучения профиля экспрессии генов в кумулюсных клетках для оценки качества ооцитов и эмбрионов. Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать улучшению нашего понимания биологических процессов, происходящих в фолликуле в течение его развития, а также помогут выявить новые биомаркеры для оценки качества ооцитов и прогноза дальнейшего развития эмбрионов, что позволит более точно осуществлять выбор эмбрионов для переноса и, тем самым, повысить результативность программ ЭКО в целом.
