По данным ВОЗ в мире бесплодием страдает до 80 млн женщин репродуктивного возраста. Одной из наиболее частых причин бесплодия является эндометриоз [1]. Эндометриоз – это доброкачественное гормональнозависимое заболевание, характеризующееся дистопией ткани, по строению и функции подобной эндометрию, за пределами слизистой матки [2]. Данным заболеванием страдает примерно 10–15% женщин репродуктивного возраста, 30–50% которых являются бесплодными [3]. Существующие возможности хирургического и медикаментозного лечения эндометриоза помогают получить долгожданную беременность лишь у 30–33% пациенток [4].
Некоторые исследователи предполагают, что одной из причин бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, являются молекулярные дефекты эндометрия, возникающие во время «окна имплантации» и нарушающие имплантацию эмбриона [5].
При этом эндометрий женщин с эндометриозом может иметь нормальную гистологическую структуру с изменениями на биохимическом уровне в период «окна имплантации» [6]. Решающую роль в процессе имплантации играет рецептивность эндометрия – комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временными и пространственными константами, определяющий способность эндометрия к имплантации [7]. Имплантация наиболее вероятна в период наибольшей рецептивности эндометрия по отношению к бластоцисте, в так называемый период «окна имплантации», возникающий на 6–8-й день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ). Так, B.A. Lessey и соавт. продемонстрировали повышение экспрессии эстрогеновых рецепторов-α (ЭРα) в сочетании со снижением или отсутствием экспрессии интегрина αvβ3 в эндометрии женщин с эндометриозом в период «окна имплантации» [8]. Однако некоторые авторы не выявили отличий в экспрессии ЭРα и прогестероновых рецепторов (ПР) в эутопическом эндометрии пациенток, больных эндометриозом, по сравнению со здоровыми женщинами [9].
Результативность программы ЭКО как одного из наиболее эффективных методов лечения бесплодия составляет 12,5% при наружном генитальном эндометриозе (НГЭ) 1–2-й стадии, по сравнению с 28,6–37,4% при трубно-перитонеальном факторе бесплодия (ТПФ) [10]. Несмотря на многочисленные исследования причин бесплодия при НГЭ, до сих пор нет однозначного мнения о том, изменяется ли рецептивность эндометрия у пациенток с данным заболеванием и экспрессия каких морфологических и молекулярных маркеров при этом нарушается.
Целью данного исследования стало изучение морфологических и молекулярно-биологических особенностей эндометрия пациенток с бесплодием и НГЭ 1–2-й стадии в период «окна имплантации».
Материалы и методы исследования
Были исследованы 72 образца биоптата эндометрия бесплодных женщин с целью исключения патологии эндометрия и подготовки к программе ЭКО. Из них 23 пациентки – с установленным на основании данных клинико-лабораторного обследования диагнозом НГЭ 1–2-й стадии (основная группа наблюдений), 32 женщины с ТПФ при отсутствии или непроходимости маточных труб (группа сравнения) и 17 пациенток с мужским фактором бесплодия (МФ) – контрольная группа.
Критериями включения пациенток в исследование стали: возраст женщин от 20 до 38 лет; регулярный менструальный цикл; наличие НГЭ 1–2-й стадии по пересмотренной классификации Американского общества фертильности, верифицированного при оперативном вмешательстве на органах малого таза и подтвержденного данными гистологического исследования (для основной группы); отсутствие других гинекологических заболеваний, влияющих на репродуктивную функцию и рецептивность эндометрия (миома матки, СПКЯ, синехии, гиперпластические процессы эндометрия, хронический эндометрит, пороки развития матки, аденомиоз); отсутствие гормонального лечения в течение 3 месяцев до проведения исследования Каждой пациентке проводился ультразвуковой мониторинг фолликулогенеза и функциональные тесты для определения пика ЛГ в моче с целью определения овуляции.
Аспирационная пайпель-биопсия эндометрия проводилась под ультразвуковым контролем из области дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratoire C.C.D.», Франция) на 6–8-й день после овуляции.
Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. После обработки образцов по стандартной общепринятой унифицированной методике их заключали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличении от х50 до х1000. Также проводилась оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х1000 в 5 полях зрения.
Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3–4 мкм. Демаскировка антигенов ткани проводилась в ретривере PTLink фирмы Dako (Дания) в цитратном буфере рН=6,0 в течение 20 мин при температуре 96оС. Для визуализации реакций применяли систему выявления REALTMEnVisionTM («DAKO», Дания). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной сывороткой (нормальный мышиный иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера.
Определение стероидных рецепторов проводили с использованием мышиных моноклональных антител к ЭРα (клон 1D5 RTU «DAKO», Дания) и ПР-А (клон 636 RTU «DAKO», Дания).
Анализ результатов ИГХ реакций для ЭРα и ПР-А проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета H-score по формуле: HS = 1a±2b±3c, где а – процент слабо окрашенных клеток, b – процент умеренно окрашенных клеток, с – процент умеренно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Степень выраженности экспрессии ЭРα и ПР-А расценивали следующим образом: 0–10 баллов – отсутствие экспрессии, 11–100 баллов – слабая экспрессия, 101–200 баллов – умеренная экспрессия, 201–300 баллов – выраженная экспрессия.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы SPSS Statistics v. 17.0. (SPSS Inc.) Все полученные количественные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), ошибка среднего (m), для качественных данных – частоты (%). Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стъюдента для 2 независимых выборок и многофакторный дисперсионный анализ (для нескольких независимых переменных). Для сравнения непараметрических данных применяли методы Круаскала–Уоллиса (для нескольких групп), попарное сравнение осуществляли с помощью критерия Манна–Уитни (для 2 групп) для несвязанных совокупностей. Для определения различий между качественными показателями использовали метод χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления, которого прибегали к построению «сетки 2х2» и «3х2». Статистически значимыми считались отличия при P<0,05 (95% уровень значимости).
Результаты исследования и обсуждение
Средний возраст пациенток основной группы составил 34,17±0,69 года и статистически не отличался ни от среднего возраста пациенток группы сравнения (32,63±0,72 года; р=0,138), ни от среднего возраста пациенток контрольной группы (33,4±1,05 года; р=0,544). У пациенток основной группы средняя длительность НГЭ составила 4,39±0,76 года. Длительность бесплодия в основной группе была статистически выше таковой в группе сравнения (5,87±0,74 против 4,18±0,46 года соответственно; р=0,048) и выше длительности бесплодия в контрольной группе (5,04±0,94 года). Это, возможно, связано с длительным периодом диагностики НГЭ и попыток хирургического и медикаментозного лечения НГЭ и бесплодия. У пациенток с НГЭ бесплодие носило в основном первичный характер – 60,9%, в отличие от 31,3% случаев первичного бесплодия при ТПФ и 33,3% – при МФ бесплодия (р=0,029). Это подтверждает недостаточную эффективность как хирургического, так и медикаментозного лечения НГЭ и первичного бесплодия у бόльшего числа пациенток.
При гистологическом исследовании эндометрий пациенток основной группы в 14 случаях (60,9%) соответствовал средней стадии секреции, в 8 случаях (34,8%) – ранней стадии секреции и в 1 случае (4,3%) – поздней стадии секреции. В 10 (43,5%) образцах эндометрия исследуемой группы отмечался очаговый склероз, что косвенно может указывать на наличие хронического эндометрита в анамнезе. Из них в 6 случаях (60%) в эндометрии ранней стадии секреции, в 3 случаях (30%) – в эндометрии средней стадии секреции и в 1 случае (10%) – в эндометрии поздней стадии секреции. Выявление очагового склероза у пациенток с НГЭ было статистически значимо связано с ранней секреторной стадией развития эндометрия (р=0,026).
При гистологическом исследовании эндометрий пациенток группы сравнения в 19 случаях (59,4%) соответствовал средней стадии секреции, в 10 случаях (31,3%) – ранней стадии секреции, в 1 случае (3,1%) – поздней стадии секреции и в 2 случаях (6,3%) – средней стадии пролиферации. В 7 (21,9%) образцах эндометрия пациенток группы сравнения отмечался очаговый склероз, вероятно, образовавшийся в результате хронического эндометрита. Из них в 2 случаях (28,6%) при ранней стадии секреции, в 5 случаях (71,4%) – при средней стадии секреции. Выявление очагового склероза у пациенток с ТПФ не было связано со стадией развития эндометрия (р=0,782).
Гистологическая картина эндометрия пациенток контрольной группы в 15 случаях (88,2%) соответствовала средней стадии секреции и в 2 случаях (11,8%) – ранней стадии секреции. Только в 2 случаях отмечался очаговый склероз (по одному случаю как в среднюю, так и в раннюю стадию секреции).
При сравнении групп не было выявлено статистически значимых различий в стадии развития эндометрия (р=0,671), однако частота выявления очагового склероза была значимо ниже у пациенток контрольной группы (р=0,03).
В поверхностном эпителии эндометрия оценивались пиноподии – специализированные структуры, ответственные за рецептивность эндометрия [11].
Среднее количество пиноподий в эндометрии средней стадии секреции пациенток с НГЭ и ТПФ бесплодия было снижено и составляло 26,57±4,46 и 24,84±2,75 соответственно и статистически не отличалось между собой (р=0,363), однако в эндометрии пациенток контрольной группы среднее количество пиноподий было статистически выше и составило 39,41±3,12 (р=0,02) (рис. 1а-в см. на вклейке).
Таким образом, гистологическая картина эндометрия пациенток с бесплодием при НГЭ 1–2-й стадии значимо не отличалась от таковой при ТПФ бесплодия. Однако для пациенток контрольной группы характерна низкая частота формирования очагового склероза и высокий уровень эндометриальных пиноподий.
При ИГХ исследовании экспрессии ЭРα и ПР-А в эндометрии пациенток с НГЭ 1–2-й стадии, ТПФ и МФ выявлены следующие изменения их уровня в зависимости от фазы развития эндометрия.
В основной группе экспрессия ЭРα в строме эндометрия ранней и средней стадии секреции была низкая с тенденцией к увеличению и в среднем составляла 50±12,25 и 62,27±19,45 балла соответственно. В эпителии эндометрия пациенток данной группы как ранней, так и средней стадии секреции отмечалась умеренная экспрессия ЭРα с тенденцией к снижению и в среднем составляла 183,75±21,54 и 109,09±16,48 балла соответственно (рис. 1д см. на вклейке).
В группе сравнения экспрессия ЭРα в строме эндометрия средней стадии пролиферации была умеренной (140±20 баллов), а в эндометрии ранней, средней и поздней стадий секреции отмечалась низкая экспрессия и в среднем составила 40,56±12,68, 39,94±7,92 и 70 баллов соответственно. Экспрессия ЭРα в эпителии эндометрия средней стадии пролиферации и ранней стадии секреции была умеренной (180±20 и 106,11±18,41 балла соответственно), с тенденцией к уменьшению, а в эндометрии средней и поздней стадии секреции отмечалась низкая экспрессия ЭРα в эпителии и в среднем составляла 70,75±13,24 и 70,0 балла соответственно (рис.1е см. на вклейке).
В контрольной группе экспрессия ЭРα в строме эндометрия как ранней, так и средней стадии секреции была низкой (50±20,0 и 60±17,61 балла), в эпителии эндометрия отмечалась умеренная экспрессия ЭРα в раннюю стадию секреции (105,0±35 балла) и низкая (70±15,04 балла) – в среднюю стадию секреции (рис.1г см. на вклейке).
При сравнении характера экспрессии ЭРα в эндометрии пациенток с разными видами бесплодия выявлен более высокий уровень экспрессии ЭРα в строме эндометрия пациенток с НГЭ и его увеличение от ранней к средней стадии секреции эндометрия (р=0,031). Экспрессия ЭРα в эпителии значимо снижалась в зависимости от фазы развития эндометрия во всех группах (р=0,038), однако средний уровень ЭРα в эпителии был статистически выше у пациенток с НГЭ (р=0,027) (рис. 2 см. на вклейке).
В основной группе уровень экспрессии ПР-А в строме эндометрия ранней стадии секреции был высоким (202,5±14,36 балла) и снижался до умеренного в эндометрии средней стадии секреции (143,64±17,54 балла). В эпителии эндометрия пациенток с НГЭ как ранней, так и средней стадии секреции отмечалась умеренная экспрессия ПР-А с тенденцией к снижению и в среднем составляла 185±25 и 120,09±24,30 балла соответственно (рис.1з см. на вклейке).
В группе сравнения уровень экспрессии ПР-А в строме эндометрия средней стадии пролиферации, ранней и средней стадии секреции был умеренным и составил 150±30, 161,11±17,98 и 156,25±8,56 балла соответственно, в поздней стадии секреции – уровень ПР-А в строме был высоким (210 баллов). Уровень экспрессии ПР-А в эпителии эндометрия средней стадии пролиферации, ранней и средней стадии секреции был умеренным с тенденцией к снижению и составил 190±10, 166,67±22,3 и 147,25±15,81 балла соответственно, в поздней стадии секреции экспрессия ПР-А в эпителии отсутствовала (1,0 балла) (рис. 1и см. на вклейке).
В контрольной группе экспрессия ПР-А в строме эндометрия как ранней, так и средней стадии секреции была умеренной и составила 195±15,0 и 147,5±13,09 балла соответственно. Экспрессия ПР-А была умеренной в эпителии эндометрия ранней стадии секреции и низкой в эндометрии средней стадии секреции (180±0 и 58,25±20,14 балла) (рис. 1ж см. на вклейке).
Уровень экспрессии ПР-А в эпителии и строме эндометрия всех групп снижался в зависимости от фазы развития эндометрия (р=0,013; р=0,032), однако статистически не различался между группами (р=0,186; р=0,503).
Известно, что на рецептивность эндометрия оказывает влияние циклическая секреция гормонов яичника. Так, уровень ЭРα повышается в пролиферативную фазу менструального цикла под действием эстрогена и снижается в секреторную фазу цикла в ответ на влияние прогестерона. В норме отмечается снижение как ЭРα, так и ПР-А в период «окна имплантации» [12, 13]. Однако прогестерон не только снижает уровень ЭРα, но и ингибирует связывание эстрадиола с рецептором, что приводит к резистентности эндометрия к эстрогенам в период «окна имплантации» [8].
Нами было выявлено достоверное повышение уровня экспрессии ЭРα как в строме, так и в эпителии эндометрия бесплодных пациенток с НГЭ 1–2-й стадии, что может быть одним из патогенетических механизмов как снижения рецептивности эндометрия, так и развития эндометриоза. Считается, что персистенция ЭРα может быть следствием снижения прогестероновой активности, так как одной из функций прогестерона является регуляция ЭРα. При эндометриозе сочетание высокого уровня эстрадиола и ЭРα стимулирует пролиферацию эндометрия, изменяет нормальный характер генной экспрессии и снижает имплантационную способность эндометрия.
Рецептор к прогестерону – фактор, широко изучающийся в контексте рецептивности эндометрия. ПР представлены двумя видами – ПР-А и ПР-В. Нарушение функции или структуры одного или обоих рецепторов неизбежно вызовет препятствие для взаимодействия с прогестероном с последующим развитием устойчивости к прогестерону, что в свою очередь приведет к эстрогеновому дисбалансу.
По данным Lee и соавт., нарушение в отношении ПР-А к ПР-В является возможным механизмом возникновения резистентности к прогестерону при эндометриозе [14]. Bueney и соавт. отметили увеличение экспрессии ПР у женщин с эндометриозом средней и тяжелой стадии [15].
В нашем исследовании у пациенток с НГЭ 1–2-й стадии уровень экспрессии ПР-А как в строме, так и в эпителии эндометрия снижался от ранней к средней стадии секреции, однако не было выявлено статистически значимого отличия от среднего уровня экспрессии ПР-А в группе сравнения и контрольной группе.
Современные представления предполагают, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности [16]. Считается, что определяющим прогностическим фактором наступления беременности является соотношение ПР-А/ЭРα в строме в диапазоне от 2 до 4 [17].
Нами выявлено, что у пациенток с НГЭ 1–2-й стадии и ТПФ соотношение ПР-А/ЭРα в эндометрии средней стадии секреции в среднем составило 5,964±2,5 и 9,481±3,57 соответственно и было статистически выше, чем соотношение ПР-А/ЭРα в эндометрии средней стадии секреции у пациенток с МФ (3,75±0,25; р=0,043).
Одним из наиболее известных морфологических маркеров рецептивности эндометрия являются пиноподии – особые выпячивания мембраны на апикальных полюсах клеток поверхностного эпителия, образующиеся под действием прогестерона. Пиноподии выявляются в эндометрии в период «окна имплантации». Хотя их роль до конца остается не известной, по-видимому, пиноподии являются местом взаимодействия эмбриона с эндометрием, так как прикрепление бластоцисты происходит на поверхности эндометриальных пиноподий. Гипотетически рецептор, необходимый для адгезии бластоцисты, локализуется на поверхности пиноподии [18].
По результатам данного исследования средний уровень экспрессии пиноподий в период «окна имплантации» статистически не отличался у пациенток с НГЭ 1–2-й стадии и ТПФ бесплодия, однако у пациенток контрольной группы количество пиноподий было значимо выше. Эти данные подтверждают роль пиноподий как гистологического маркера бесплодия.
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о том, что у пациенток с бесплодием, сочетающимся с НГЭ 1–2-й стадии, происходит нарушение рецептивности эндометрия в период «окна имплантации», что проявляется в снижении количества пиноподий и дисбалансе гормональных рецепторов. Особенностью изменения эндометрия в «окно имплантации» при НГЭ 1–2-й стадии является достоверно более высокий уровень ЭРα в эпителии и строме. Это в свою очередь может являться одной из ведущих причин бесплодия и более низкой эффективности программы ЭКО у пациенток с данным заболеванием.
Однако необходимы дальнейшие исследования с целью изучения большего спектра молекулярных маркеров рецептивности эндометрия, оценки их взаимодействия и степени изменения экспрессии, что поможет найти эффективные методы коррекции нарушений с целью повышения частоты имплантации у пациенток с НГЭ.
