Известно, что кондиломы половых органов, вызываемыевирусомпапилломычеловека(ВПЧ), являются одним из самых распространенных в мире заболеваний, передающихся половым путем [1, 6]. Проблема их диагностики и лечения привлекает внимание исследователей различных специальностей многих стран ввиду высокой контагиозности и тенденции к распространению данного заболевания, а также способности ВПЧ инициировать злокачественные процессы нижних отделов половых путей женщины.
В настоящее время для лечения остроконечных кондилом (ОК) вульвы используют крио и лазерную терапию, радиоволновое и хирургическое иссечение, химиопрепараты и другие методы [1]. Однако их эффективность остается низкой, а частота рецидивирования – высокой [6]. Поэтому поиск и клиническая оценка эффективности новых методов лечения заболеваний наружных половых органов, обусловленных ВПЧ, остается актуальной проблемой гинекологии.
В связи с этим особый интерес представляют методы флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ), которые широко применяются в последнее десятилетие для диагностики и лечения как онкологических, так и неонкологических заболеваний, в том числе в гинекологии [2, 9, 17]. Метод ФДТ основан на деструкции биологических тканей в результате взаимодействия светового излучения определенной длины волны и фотосенсибилизатора (ФС), предварительно введенного в организм пациента. В результате поглощения света молекулой ФС возникает серия фотофизических процессов, приводящих к образованию синглетного кислорода, крайне реактивного цитотоксического агента [4]. Мишенями фотодинамического воздействия являются непосредственно патологические клетки, сосудистая система патологического очага и окружающих тканей и иммунная система [9].
При системном введении ФС, применяемые в клинической практике, длительно задерживаются в патологических очагах (включая ткани злокачественных опухолей, очаги воспаления и клетки, инфицированные вирусом) и быстро выводятся из окружающей здоровой ткани [7]. Данный феномен, в сочетании со способностью ФС флуоресцировать в красной области спектра, лежит в основе метода ФД [7, 8]. Флуоресценция ФС позволяет также изучать кинетику их накопления и выведения в тканях in vivo и ex vivo, что крайне необходимо на стадии разработки метода ФДТ для лечения конкретной патологии для оптимизации времени проведения сеансов светового воздействия [10, 12].
При системном введении экзогенных ФС,ввиду их выраженной кожной фототоксичности, необходимо соблюдение светового режима, нанесение солнцезащитных средств и прием антиоксидантов [9]. Поэтому особое внимание уделяется разработке методов ФД и ФДТ с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) [2, 7, 17], которая является эндогенным соединением, одним из промежуточных продуктов синтеза гема. Ее избыточное введение в организм приводит к ингибированию последнего этапа синтеза гема и накоплению его предшественника – эндогенного протопорфирина IX, который обладает как фотосенсибилизирующими, так и флуоресцентными свойствами [7, 17]. При этом в патологических клетках индуцируется и накапливается больше протопорфирина IX, чем в окружающих нормальных тканях [7, 8, 11, 17].
Помимо эндогенного происхождения, большим преимуществом 5-АЛК является возможность ее местного применения в виде мазей, гелей и растворов, что позволяет избежать системного воздействия.
Клинические испытания ФД и ФДТ фоновых и предраковых заболеваний вульвы, влагалища и шейки матки при местном нанесении препаратов на основе 5-АЛК проводились как в нашей стране, так и за рубежом и представлены в ряде обзоров [2, 17]. Анализ публикаций показывает, что эффективность ФДТ во многом зависит от времени экспозиции 5-АЛК и ее биодоступности в тканях, поскольку оба фактора влияют на накопление 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX [11, 15–19]. Применение ФДТ при местном использовании мази 5-АЛК для лечения кератинизированных ОК вульвы оказалось
неэффективным в силу ограниченного проникновения индуктора в утолщенный поверхностный слой эпидермиса [15]. Однако можно предположить, что данное ограничение не выполняется при пероральном приеме 5-АЛК, поскольку в этом случае утолщенный эпидермис не препятствует накоплению ФС в ткани. Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что такие исследования ранее не проводились.
Как отмечалось ранее, при разработке методов ФДиФДТ ключевым моментом является изучение
кинетики накопления ФС как в нормальных, так и в патологических очагах. Это позволяет определить временнóй интервал, при котором содержание ФС в патологическом очаге максимально, а в окружающих нормальных тканях – минимально, т.е. имеет место максимальный флуоресцентный контраст между патологическим очагом и окружающими нормальными тканями.
В связи с этим целью данной работы было изучение кинетики накопления 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX в коже, слизистой оболочке и ОК вульвы у женщин после перорального приема раствора аласенса и выбор оптимальных временнeх режимов проведения ФД и ФДТ. Исследование проводили in vivo методом локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС) [13, 14].
Материал и методы исследования
В исследовании приняли участие пациентки с ОК (n=14). Средний возраст пациенток составил 24±0,5 года. Каждая третья пациентка имела в анамнезе уреаплазмоз и кандидоз, у каждой второй пациентки имелась патология шейки матки (лейкоплакия, атипический эпителий, овули Наботи, цервикальная интраэпителиалная неоплазия).
В исследовании применяли препарат аласенс, который имеет в своем составе стандартную субстанцию 5-АЛК (ГНЦ РФ «НИОПИК», Москва), перорально в дозе 25 мг/кг массы тела.
Для проведения ЛФС использовали компьютеризованную спектрально-флуоресцентную диагностическую установку «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер», ИОФ РАН, Москва). Измерения проводили с помощью волоконно-оптического диагностического катетера, выходная мощность возбуждающего лазерного излучения с конца катетера составляла не более 3 мВт. Для возбуждения флуоресценции использовали лазерное излучение с длиной волны 407 нм, которое попадает в полосу максимального поглощения порфиринов. Спектры регистрировали в диапазоне 420–750 нм, спектральное разрешение при использовании волоконно-оптического диагностического катетера составляло <5 нм.
Для проведения измерений волоконно-оптический диагностический катетер подводили к поверхности аногенитальной области. Спектры измеряли при контакте катетера с поверхностью ткани в участках визуально неизмененной кожи, слизистой оболочки вульвы и в ОК. Количество спектров, записываемых при каждом обследовании, зависело от числа визуализируемых кондилом и составляло от 15 до 40 (в среднем около 20). Спектры измеряли до приема аласенса и через 1, 2, 3, 5, 7 ч после его перорального приема.
Для оценки накопления протопорфирина IX в тканях использовали спектрально-флуоресцентный диагностический параметр D . Величину данного параметра определяли по отношению интегральной интенсивности регистрируемого спектра в области максимальной флуоресценции протопорфирина IX (620–660 нм) к таковой в области максимума аутофлуоресцентного изучения (470–520 нм). Данная методика оценки спектрально-флуоресцентных данных была разработана совместно МНИОИ им. П.А. Герцена и ИОФ им. А.М. Прохорова РАН для флуоресцентной диагностики ранних форм рака с использованием 5-АЛК [8, 14].
На установке «Спектр-«Кластер» величина параметра D автоматически рассчитывается в реальном режиме времени в каждой точке ткани и вносится в электронный протокол локальных измерений спектров. На основании протоколов исследования вычисляли среднее значение параметра Df в коже вульвы, слизистой оболочке вульвы, в ОК для каждой пациентки. На основании полученных средних значений вычисляли средние значения параметра D для каждой временнóй точки у пациенток всей группы.
Флуоресцентный контраст (К ) ОК на фоне окружающей нормальной ткани определяли по отношению усредненной (по всей группе пациенток) величины параметра D для ОК, к таковой в нормальной ткани [13].
Статистические расчеты производились с помощью пакета «Analysis Tool Pack», Statistica v. 7.0. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратичное отклонение (δ), стандартная ошибка среднего (m), медиана (Ме), 95% доверительный интервал. Для отображения разброса значений и других характеристик переменных использованы коробчатые диаграммы [5].
Результаты исследования и обсуждение
При возбуждении в области 407 нм спектры аутофлуоресценции тканей вульвы, измеренные до приема аласенса, были близки по форме и характеризовались широкой полосой излучения с максимумом в районе 480–500 нм. Данные спектры являются результатом наложения спектров флуоресценции отдельных эндогенных флуорофоров, флуоресценция которых возбуждается излучением с данной длиной волны. К ним относятся элементы соединительной ткани коллаген и эластин, различные виды флавинов – элементов дыхательной цепи, а также порфирины. Последние, как известно, участвуют
в биосинтезе гема в клетках или являются продуктами биосинтеза сапрофитной или патогенной микрофлоры при бактериальной инфекции [7]. Необходимо отметить, что ни у одной из пациенток данной группы в спектрах аутофлуоресценции исследуемых тканей до приема аласенса не было выявлено характеристических пиков флуоресценции эндогенных порфиринов в красной области спектра. Величина диагностического параметра D составляла 0,1–0,2 отн. ед.
На рис. 1 (см. на вклейке) представлены типичные спектры лазер-индуцированной флуоресценции, измеренные у отдельной пациентки через 1 ч после перорального приема аласенса, в которых на фоне широкой полосы излучения аутофлуоресценции появляется характерный пик флуоресценции протопорфирина IX в красной области спектра с максимумами на 635 нм. Наличие этого пика свидетельствует о начале процесса индукции эндогенного протопорфирина IX. Величина диагностического параметра D возрастет до 0,5 в спектрах здоровой слизистой оболочки и до 0,7 в спектрах ОК.
На (рис 2, см. на вклейке) представлены типичные спектры флуоресценции, измеренные у той же пациентки через 5 ч после приема аласенса. Можно видеть, что интенсивность индуцированной флуоресценции в красной области спектра значительно возрастает во всех исследованных тканях, причем наибольшая интенсивность протопорфирина IX регистрируется в спектрах ОК.
Величина диагностического параметра D возрастет до 0,6 в спектрах здоровой кожи и до 4,4 в
спектрах слизистой оболочки вульвы. В спектрах, измеренных в участках ОК, величина параметра D возрастет наиболее значительно до 11,9.
Результаты оценки кинетики накопления ФС в тканях вульвы у всех пациенток группы представлены на рисунке 3.
Как видно на данном рисунке, накопление протопорфирина IX в слизистой оболочке и ОК вульвы значительно возрастет через 3 ч после перорального приема и в последующие 4 ч меняется незначительно (фаза плато). Через 7 ч в этих тканях регистрируется второй пик накопления протопорфирина IX. Что касается кожи вульвы, максимум накопления протопорфирина IX достигается через 3 ч после приема аласенса и сохраняется на этом уровне в течение всего срока наблюдения.
На рис. 3 (см. на вклейке) показаны результаты оценки величины возникающего флуоресцентного контраста (К ) ОК относительно нормальной слизистой оболочки и кожи вульвы.
Можно видеть, что максимальный флуоресцентный контраст (К =2) относительно слизистой оболочки вульвы достигается уже через 2 ч после приема аласенса и остается на этом уровне во все сроки наблюдений. Относительно кожи вульвы флуоресцентный контраст значительно выше во все сроки наблюдений и достигает максимальных значений через 4 ч (К =8) и 7 ч (К =10) после приема аласенса.
Изучение накопления 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX в ОК вульвы впервые проведено в работе M.K. Fehr и соавт. после местного нанесения 5-АЛК (в виде 2,5% мази и 20% крема) [15]. С помощью флуоресцентного анализа изображений in vivo была показана повышенная индукция ФС как в ОК, так и в невидимых глазом латентных очагах. Максимальный флуоресцентный контраст между ОК и близлежащей нормальной тканью достигался через 3 ч после наложения 2,5% крема 5-АЛК. Максимальная интенсивность флуоресценции протопорфирина IX регистрировалась через 2–3 ч, при этом ее интенсивность в эпидермисе была в 2 раза выше, чем в сосочковом слое дермы. Также было показано, что утолщенный поверхностный слой эпидермиса препятствует проникновению 5-АЛК,
в то время как 5-АЛК легко проникает в неороговевший многослойный плоский эпителий и
индуцирует выработку в нем протопорфирина IX. Авторы заключили, что ФДТ кератинизированных кондилом вульвы может быть неэффективной при местном использовании мази 5-АЛК.
Позднее в работе Stefanaki и соавт. [18] было показано, что максимум накопления 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX в ОК вульвы достигается через 6 ч после нанесения 20% мази 5-АЛК и сохраняется в течение последующих 5 ч.
Результаты, полученные в данной работе, показывают, что после перорального приема аласенса
во всех тканях вульвы индуцируется протопорфирин IX. Накопление ФС в кожных покровах подтверждается временнeми фототоксическими реакциями, которые наблюдались у 23% пациенток в виде гиперемии кожных покровов при воздействии солнечного света [3]. Накопление ФС в ОК достигает максимальных значений через 3 ч, сохраняется на этом уровне в течение 3 ч и затем незначительно возрастает через 7 ч после приема. Изучение флуоресцентного контраста ОК
относительно окружающих нормальных тканей показало, что он возникает уже через 2 ч после
приема и сохраняется во все последующие сроки наблюдения. Это свидетельствует о повышенном
накоплении 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX в ОК и позволяет сделать вывод о
возможности ФД данной патологии при пероральном приеме 5-АЛК. Оптимальным сроком для проведения ФД является интервал от 3 до 7 ч после приема, когда величина флуоресцентного
контраста достигает максимальных значений и патологические очаги могут быть визуализированы на фоне окружающих нормальных тканей по характерному свечению в красной области спектра. В то же время, имеющиеся различия в содержании ФС позволяют сделать вывод о возможности проведения в указанные сроки ФДТ с минимальным повреждением окружающих нормальных тканей.
Таким образом, в данной работе показана принципиальная возможность и выявлены оптимальные сроки проведения ФД и ФДТ ОК вульвы при пероральном приеме препарата аласенс.
