Проблема бесплодия супружеских пар приобретает сегодня не только медицинское, но и социально-демографическое и экономическое значение. На протяжении многих лет считалось, что бесплодие в большей степени связано с проблемами в репродуктивной системе женщины. Однако исследования последних лет показали, что мужской фактор занимает 50% в структуре причин бесплодия [1].
Многие исследователи сходятся во мнении, что за последние 50 лет отмечается тенденция к ухудшению показателей спермограммы у мужчин, что проявляется в сокращении объема эякулята, снижении концентрации и подвижности сперматозоидов и увеличении числа их патологических форм [2].
На сегодняшний день имеется достаточное количество данных, демонстрирующих, что при оплодотворении сперматозоид выполняет не только функцию «доставки мужского генома», но также содержит несколько важных для дальнейшего нормального развития эмбриона морфологических ультраструктур. Эти так называемые «факторы сперматозоида» вовлечены в процессы развития эмбриона, такие как сингамия, дробление, эпигенетическая регуляция. Следовательно, успех оплодотворения и последующего развития эмбриона зависит от параметров развития, ядерной и цитоплазматической компетентности мужской половой клетки.
Спектр патологических состояний, сопровождающихся нарушениями мужской репродуктивной функции, чрезвычайно широк и включает различные эндогенные и экзогенные факторы. Так, к нарушению фертильности у мужчин могут приводить метаболические, эндокринные, сосудистые нарушения, воспалительные процессы, заболевания нервной системы и психологические расстройства, врожденные или приобретенные заболевания, воздействие химических и физических факторов окружающей среды и др. [3]. Кроме того, известно, что некоторые генетические факторы детерминируют развитие патозооспермии у мужчин. Согласно литературным данным, наличие микроделеции в локусе AZF хромосомы Y приводит к различным нарушениям сперматогенеза у мужчин, вплоть до азооспермии. Следует отметить, что данная мутация может передаваться от отца к сыну, вследствие чего разрабатываются различные подходы по профилактике передачи данной мутации потомству мужского пола [4]. Важно отметить, что причины мужского бесплодия часто остаются неизвестными и при современных методах диагностики.
Особенно актуальным остается изучение влияния табакокурения и употребления этанола на репродуктивную функцию. В исследовании Z.B. Meri с соавт. выявлено негативное воздействие табачного дыма на спермиогенез, на конденсацию хроматина и процессы апоптоза в сперматозоидах [5, 6]. Следовательно, отказ от курения, что особенно актуально в настоящее время, является одним из необходимых условий для успешного лечения бесплодия [7].
Внедрение ИКСИ
Непрерывное совершенствование методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволило достигнуть значительного прогресса в лечении как женского, так и мужского бесплодия.
Так, внедрение метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) дало возможность получения генетически родного потомства мужчинам с тяжелыми формами патозооспермии. Однако, при проведении процедуры ИКСИ минуются некоторые этапы отбора сперматозоидов, осуществляемые in vivo, а отдельные шаги существенно отличаются от физиологического процесса, возникают сомнения в безопасности этого метода. Некоторые исследователи утверждают, что ИКСИ может увеличить риск оплодотворения ооцита сперматозоидом с генетическими или функциональными аномалиями, поскольку отбор сперматозоидов при ИКСИ основан исключительно на микроскопической оценке их подвижности и морфологии [8, 9].
Зачастую генетические аномалии эмбрионов, полученных при помощи ИКСИ, как и невынашивание беременности после проведения данной процедуры, оказываются обусловленными наличием повреждений в генетическом материале сперматозоида, использованного для оплодотворения [10]. Кроме того, многочисленные исследования описывают повышение частоты количественных хромосомных аберраций de novo, цитогенетически выявляемых структурных хромосомных аберраций, хромосомных анеуплоидий и дисомии половых хромосом в эмбрионах, развивающихся после применения ИКСИ [11].
Селекция сперматозоидов для ИКСИ
In vitro селекция сперматозоидов для ИКСИ является крайне важным моментом. Однако, их визуальная оценка лишь по таким критериям, как морфология и подвижность, может допустить отбор единичного сперматозоида, несущего разного рода патологии. Существенно снизить количество аномальных сперматозоидов, в том числе с дефектами ДНК, при подготовке спермы к оплодотворению in vitro, позволяют разнообразные методики обработки спермы, широко применяющиеся в рутинной практике отделений и лабораторий, применяющих методы ВРТ. Большинство этих методик дает возможность выделить сперматозоиды, которые обладают жизнеспособностью, подвижностью и нормальной морфологией. Однако, несмотря на это, угроза использования сперматозоида с нарушениями в структуре ДНК для ИКСИ все же сохраняется.
В 1999 г. израильские ученые предложили новую методику отбора материала – ИМСИ (intracytoplasmic morphologically normal sperm injection – интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормального сперматозоида), а в 2004 г. они продемонстрировали клиническую эффективность этого метода [12].
По их данным, вероятность наступления беременности после ИМСИ у определенных групп пациентов была значительно выше, чем после обычного ИКСИ.
ИМСИ является существенным усовершенствованием процедуры ИКСИ и основывается на микроинъекции тщательно отобранного по морфологическим критериям сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки. Перед проведением ИМСИ строение сперматозоидов детально изучается под микроскопом со специальным объективом и выведением изображения на большой экран. Увеличение при ИМСИ составляет до 6 000 раз (600 оптическое и 10 – цифровое), в то время как при ИКСИ – только до 400.
Однако в медицинской практике все больше рождается споров о показаниях к проведению данного метода и его эффективности с точки зрения частоты наступления беременности и /или родов живым плодом.
F. Boitrelle и соавт. в 2014 году был проведен систематический обзор литературы по данному вопросу. Единственным доказанным показанием к ИМСИ является повторная неудача имплантации после стандартного ИКСИ. Все другие потенциальные показания к ИМСИ требуют дальнейшего изучения [13].
In vivo, прежде чем произойдет оплодотворение яйцеклетки, сперматозоиды преодолевают несколько барьеров и анатомических структур, включающих цервикальную слизь, матку, маточные трубы, кумулюсные клетки и блестящую оболочку ооцита. Жесткий отбор функциональных сперматозоидов на этих участках совершается благодаря разнообразным механическим, биохимическим и биофизическим механизмам. На данный момент полное воспроизведение процесса естественного отбора сперматозоидов, осуществляемого на разных уровнях женского репродуктивного тракта, не представляется возможным в условиях in vitro. В связи с этим возникает необходимость в разработке новых подходов, имитирующих процесс оплодотворения и позволяющих минимизировать риски, связанные с выбором единичного зрелого сперматозоида без потери его жизнеспособности для процедуры ИКСИ.
Биологическая роль гиалуроновой кислоты в селекции сперматозоидов
Одним из ключевых факторов селекции сперматозоидов in vivo является их способность связываться с гиалуроновой кислотой (ГК).
ГК, или гиалуронат – это кислый мукополисахарид, входящий в состав соединительной, эпителиальной и нервной тканей позвоночных животных и обнаруживающийся в различных биологических жидкостях организма.
В женской репродуктивной системе ГК может играть решающую роль при отборе функционально компетентных сперматозоидов, пригодных для оплодотворения. Данное вещество является одним из основных компонентов лучистого венца, окружающего ооциты человека и состоящего из кумулюсных клеток и белков кумулюсного комплекса. Внеклеточный матрикс ооцит-кумулюсного комплекса образован полимеризованной ГК. Лишь зрелые сперматозоиды, характеризующиеся наличием специфических рецепторов связывания с ГК, способны достигнуть яйцеклетки и оплодотворить ее.
Зрелые сперматозоиды человека несут, как минимум три специфических белка, способных связываться с ГК. Одним из таких белков-рецепторов ГК является белок PH-20 или SPAM1 (от англ. sperm adhesion molecule – молекула адгезии сперматозоида), который участвует в акросомальной реакции, обладает гиалуронидазной активностью и вовлечен в процесс связывания сперматозоида с блестящей оболочкой ооцита.
Второй белок, RHAMM (от англ. receptor for hyaluronanmediated motility – рецептор гиалуронат-опосредованной подвижности) связан с подвижностью сперматозоида. Третий рецептор – HAPB (hyaluronic acid binding glycoprotein – ГК-связывающий гликопротеин) принимает участие в передвижении сперматозоида и его слиянии с оолеммой.
В процессе сперматогенеза, происходящего в яичке человека, элонгированные сперматиды сбрасывают цитоплазматическую каплю, а их плазматическая мембрана претерпевает молекулярные перестройки, определяющие формирование в ней сайтов связывания с ГК и блестящей оболочкой ооцита. В конце спермиогенеза со степенью зрелости сперматозоидов, целостностью ДНК, частотой возникновения хромосомных анеуплоидий и оплодотворяющей способностью коррелируют уровни экспрессии двух специфических белков. Этими белками являются белок теплового шока HspA2, относящийся к классу шаперонов и участвующий в процессе мейоза и креатинкиназа (КK) – фермент, участвующий в энергетическом обмене сперматозоидов. Для зрелых сперматозоидов характерна повышенная концентрация HspA2 и низкий уровень содержания КК. В случае же задержки созревания в цитоплазме сперматозоидов наблюдается пониженный уровень экспрессии HspA2, что нередко ассоциируется с нарушениями в мейозе, и, как следствие, к хромосомным аномалиям. Установлено, что частота анеуплоидий в зрелых сперматозоидах, по сравнению с незрелыми, ниже в пять с лишним раз [14].
Высокий уровень КК в незрелых сперматозоидах объясняется нарушением, возникающим в конечной стадии спермиогенеза, когда при нормальном развитии происходит удаление излишка цитоплазмы с шейки будущего сперматозоида в виде «остаточного тельца». При задержке или остановке созревания в сперматозоидах остается большее количество цитоплазмы с КК и другими цитоплазматическими белками, определяются повышенные уровни перекисного окисления липидов. В связи с тем, что мембрана этих сперматозоидов не претерпевает молекулярных перестроек, такие сперматозоиды остаются незрелыми. Они не в состоянии взаимодействовать с блестящей оболочкой ооцита и участками связывания ГК, и, как следствие, не способны к оплодотворению. Те же сперматозоиды, у которых произошло удаление излишка цитоплазмы, закончилось созревание ядра, а в плазматической мембране завершились молекулярные перестройки, способны к связыванию с ГК не только in vivo, но и в лабораторных условиях. Гиалуронат-связанные сперматозоиды обладают лучшей морфологией [15, 16] и несут в себе меньше анеуплоидий или разрывов ДНК [17].
Таким образом, ГК в качестве «физиологического селектора», применима на практике in vitro. Отбор сперматозоидов с улучшенными характеристиками, определяющими зрелость и генетическую целостность мужских гамет по способности связываться с ГК, может служить для улучшения вклада отцовского генома в развитие эмбриона при искусственном оплодотворении и, таким образом, оказать положительное влияние на клинические исходы при лечении бесплодия.
Клиническая эффективность ПИКСИ
Имеющиеся в литературе данные относительно эффективности физиологической селекции сперматозоидов (ПИКСИ) противоречивы.
В ряде крупных исследований отмечена положительная тенденция относительно улучшения качества полученных эмбрионов [16] и частоты наступления беременности. Имеется ряд исследований, которые демонстрируют статистически значимое снижение частоты самопроизвольных абортов после ИКСИ связанными с ГК сперматозоидами в сравнении с теми, что были отобраны лишь посредством визуальной оценки. Данные клинические результаты подтверждают выводы, полученные в проведенных ранее исследованиях биохимических и молекулярных маркеров функциональной зрелости сперматозоидов человека [17]. Кроме того, использование для ИКСИ сперматозоидов, отобранных при помощи ГК, увеличивает показатель частоты имплантаций [16].
Результаты этих исследований свидетельствуют об отсутствии негативных последствий, оказываемых на ооциты-реципиенты и преимплантационный эмбриогенез при использовании ГК для селекции сперматозоидов в циклах ИКСИ. Улучшение качественных характеристик сперматозоидов, способных связываться с ГК, подтверждено рядом исследований. Так, было продемонстрировано отсутствие фрагментации ДНК в ядре сперматозоидов, связавшихся с ГК [18]. Кроме того, была доказана эффективность селекции сперматозоидов, связывающихся с ГК, в снижении частоты анеуплоидий как при олигозооспермии, так и при нормальной концентрации половых клеток. При этом наблюдается существенное уменьшение частоты дисомий и диплоидий хромосом [15, 16].
В дополнительных исследованиях было продемонстрировано наличие обратной корреляции между индексом фрагментации ДНК в сперматозоидах и исходом беременности. Данный индекс связан с «отцовскими» эффектами, приводящими к ухудшению качества бластоцист и снижению частоты имплантации [19–21]. В систематическом обзоре 11 исследований, включающих 1549 циклов ЭКО и ИКСИ, было показано, что повреждение спермальной ДНК обладает статистически достоверной прямой корреляцией с частотой самопроизвольных абортов [22]. Кроме того, снижение активности шаперона HspA2, присущее незрелым сперматозоидам, связано с нарушением транспорта ферментов репарации ДНК и, таким образом, с увеличением количества разрывов и фрагментации ДНК, что снижает частоту наступления беременности.
На способности связываться с ГК отражается и морфологическая целостность ядра сперматозоида. При помощи микроскопии высокого увеличения (MSOME) было обнаружено, что количество гамет с нормальным ядром (согласно критериям MSOME), среди сперматозоидов, связавшихся с ГК, существенно выше, чем среди сперматозоидов, погруженных в поливинилпирролидон (14,5 и 11% соответственно) [23]. Использование феномена связывания сперматозоидов с гиалуронатом способствует селекции единичного зрелого, функционально компетентного сперматозоида с целостной ДНК, снижая, таким образом, потенциальные риски возникновения побочных эффектов, оказываемых вкладом отцовского генома в развитие эмбриона [24].
Показано, что при индексе связывания сперматозоидов с ГК ≤ 65% селекция сперматозоидов с использованием гиалуроната приводит к статистически значимому снижению частоты спонтанных абортов [25]. Ранее эти же авторы привели убедительные доказательства того, что отбор сперматозоидов с нормальным ядром и интактной ДНК значительно улучшает качество эмбрионов, существенно уменьшает степень фрагментации эмбрионов третьего дня, а также способствует формированию бластоцист хорошего качества, увеличивая частоту имплантации и наступления клинической беременности [26]. Существенно возрастает и скорость развития эмбрионов.
Таким образом, благодаря значительному снижению степени фрагментации ДНК и нарушений морфологии ядра, инъекция ооцитов сперматозоидами, связанными с ГК, ведет к значительному улучшению показателей оплодотворения и качества эмбрионов и, как следствие, увеличивает вероятность наступления беременности.
Вместе с тем, в ряде публикаций приводятся сведения об отсутствии различий в частоте оплодотворения и наступления беременности после введения гиалуронат-связанных сперматозоидов, что может быть обусловлено малой выборкой пациентов, участвовавших в данных исследованиях [27–29].
Прогностическая значимость оценки процента фрагментация ДНК сперматозоидов
Для предотвращения передачи генетических дефектов и повышения эффективности методов ВРТ, особенно при применении методики ИКСИ необходима правильная оценка целостности генома мужских половых клеток [30, 31]. Однако, она не всегда возможна при использовании стандартного анализа спермы, рекомендованного ВОЗ [32]. Сперматозоид, морфологически расцененный как нормальный, в ряде случаев может иметь дефекты в целостности ДНК [33].
Отцовский эффект, обуславливающий нарушения эмбрионального развития, может быть связан с такими генетическими факторами, как генные мутации, различные эпигенетические нарушения, микроделеции, анеуплоидии, повреждения ДНК и нарушения компактизации хроматина [34–36]. Относительно недавно обнаруженная причина мужского бесплодия, которая интенсивно исследуется в последнее десятилетие – фрагментация ДНК сперматозоидов [37–44]. Она включает двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК. Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК, не вполне ясны, однако известно, что сперматозоиды человека часто имеют высокий уровень таких повреждений. Предполагается, что их причиной могут быть нерепарированные повреждения ДНК, дефекты ремоделинга хроматина, возникающие в ходе сперматогенеза. Источниками фрагментации хроматина сперматозоидов в настоящее время также считаются апоптоз и окислительные процессы [45]. Комплекс этих явлений в сперматозоидах стал детально исследоваться лишь в последние годы и является еще предметом дискуссии.
Во многих исследованиях установлено негативное действие высокого процента поврежденной ДНК в сперматозоидах на частоту наступления беременности. Авторы этих работ полагают, что повреждения ДНК могут служить диагностическим маркером негативного отцовского вклада в отношении преимплантационного развития человека[46].
Другие исследователи доказывают, что фрагментация ДНК не оказывает влияния на оплодотворение, но имеет важное значение для формирования бластоцист и имплантации. Необходимо отметить, что ни один из рекомендованных ВОЗ параметров спермы, таких как объем, число сперматозоидов, подвижность, морфология не дают прогноза низкой частоты формирования бластоцист [47].
В ряде работ установлена отрицательная корреляция между разрывами ДНК и вероятностью оплодотворения методом ЭКО и ИКСИ. Так, в исследовании [46] выявлено, что при фрагментации ДНК >10% (выявленной методом TUNEL) снижается частота оплодотворения, при этом взаимосвязи с морфологией эмбрионов обнаружено не было. Отсутствие ассоциации фрагментации ДНК со снижением частоты оплодотворения, обнаруженное многими авторами, находится в соответствии с представлением о том, что нарушения в отцовской ДНК не проявляются до активации эмбрионального генома, которая начинается на 8-клеточной стадии у человека. Высокий уровень фрагментации ДНК манифестирует при формировании бластоцисты.
Большой интерес представляет работа А.М. Феськова и соавт. [46], согласно которой в 80% случаев имеется корреляция между результатами теста связывания с ГК и анализа фрагментации ДНК сперматозоидов, что позволяет отнести методику отбора сперматозоидов по способности их к связыванию с ГК к методам повышения эффективности ВРТ и предотвращения передачи генетических дефектов, особенно при ИКСИ.
Заключение
Несомненно, для окончательного подтверждения положительного влияния различных методик селекции сперматозоидов, таких как ПИКСИ и ИМСИ на исход процедуры экстракорпорального оплодотворения, необходимо проведение дальнейших крупномасштабных исследований, которые включали бы еще больший объем выборки. Однако, уже сейчас, опираясь на данные постоянно увеличивающегося количества публикаций, сообщающих о положительном эффекте использования техники селекции сперматозоидов по связыванию с ГК, можно сделать вывод о высокой перспективности данного подхода для внедрения в рутинную практику. Благодаря полному отсутствию токсичности ГК, а также возможности снижать частоту возникновения генетических осложнений, применение методики ПИКСИ в качестве альтернативы традиционному ИКСИ позволит существенно улучшить характеристики преимплантационного эмбриогенеза и, в конечном счете, увеличить количество благоприятных исходов ВРТ.
Самостоятельное диагностическое и прогностическое значение для супружеских пар с бесплодием, прибегающим к ВРТ, имеет определение процента фрагментации ДНК сперматозоидов. Несмотря на то, что механизмы образования разрывов не до конца ясны, исследование фрагментации ДНК сперматозоидов может улучшить анализ спермы и служить эффективным прогностическим инструментом, выявляющим мужской фактор нарушения фертильности.
