В научных статьях сообщается о высокой частоте встречаемости при бесплодии у женщин
аутоантител разной специфичности: антифосфолипидных, антинуклеарных, антитиреоидных,
антиовариальных, антител к гонадотропным гормонам, ламинину и других [2, 6, 8]. Особый
научный и практический интерес представляет исследование возможного влияния аутоантител
на эффективность программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Одним из наиболее важных этапов программы ЭКО является получение достаточного количества зрелых жизнеспособных ооцитов для дальнейшего оплодотворения их in vitro. Рост фолликулов, выбор доминантного, созревание ооцита в доминантном фолликуле, овуляция и формирование желтого тела регулируются множеством факторов. Для их осуществления необходимы фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны, эстрадиол (Э), прогестерон (ПГ) и тестостерон (Т) [3, 14]. Развитие ооцита осуществляется в фолликулярной жидкости (ФЖ), которая образована секретом клеток гранулезы и плазматическим транссудатом и содержит высокие концентрации стероидных гормонов, иммуноглобулины и цитокины [11, 16]. Ее состав оказывает выраженное воздействие на созревание ооцита.
Нарушенная имплантация является самой значительной причиной ранней эмбриональной смертности [7]. На этапах имплантации и раннего развития беременности наибольшее значение имеют хорионический гонадотропин (ХГ) и ПГ [4, 17].
У женщин с бесплодием наблюдали продукцию аутоантител к гонадотропинам, распознающих α- и β- субъединицы ФСГ и ЛГ [12]. Частота встречаемости их была значительно выше у женщин, получавших лечение гонадотропинами. В сыворотке крови и в ФЖ обнаружены повышенные концентрации антител к ФСГ (IgG, IgA), которые ассоциировались с плохим ответом яичников на стимуляцию препаратами ФСГ [10].
У женщины с бесплодием и неэффективными попытками ЭКО выявили антитела к ХГ, способные нейтрализовать биологическую активность гормона in vitro, и предположили, что они могут служить возможной причиной самопроизвольного прерывания беременности после ЭКО [5]. Антитела к ПГ с высокой частотой встречались при невынашивании беременности, при этом вне беременности у женщин часто выявлялась гипоплазия эндометрия [1].
Цель исследования: оценить у женщин с бесплодием продукцию аутоантител к гормонам
репродуктивной системы, возможность их присутствия в ФЖ и ассоциации с исходом лечения
в циклах ЭКО.
Материал и методы исследования
Проводилось проспективное исследование. Исследуемую группу составили 60 женщин
репродуктивного возраста (средний возраст 32,3±4,2 года) с разными формами бесплодия:
32 (53,3%) с первичным и 28 (46,7%) с вторичным бесплодием со средней длительностью 5,7±4,8
и 7,5±5,4 года соответственно. Контрольная группа представлена 56 здоровыми фертильными женщинами (средний возраст 30,4±2,6 года), у которых ранее были 1 или 2 физиологические беременности.
В исследуемой группе у 30 (50%) пациенток наблюдался трубно-перитонеальный фактор бесплодия, у 11 (18,3%) – эндокринная форма бесплодия, в том числе у 10 (16,7%) – СПКЯ, у 18 (30%) – наружный генитальный эндометриоз. В анамнезе у 12 (20%) пациенток были самопроизвольные
потери беременности в I триместре (на среднем сроке 6,7±3,7 нед гестации), у 11 (18,3%) – эктопические беременности, у 7 (11,7%) – своевременные роды, у 14 (23,3%) – медицинские аборты. У 45 (75%) женщин ранее были неэффективные попытки ЭКО, их среднее число составляло 1,8±0,8 попытки на пациентку.
Стимуляция яичников у 50 (83,3%) пациенток проводилась по длинному протоколу с использованием препаратов рекомбинантного ФСГ и агониста гонадотропин-рилизинг гормона, у 10 (16,7%) пациенток – по короткому протоколу с использованием только рекомбинантного ФСГ – у 5 (8,3%) или с добавлением антагониста гонадотропин-рилизинг гормона – у 5 (8,3%). Для запуска овуляции вводили препарат ХГ. Наличие «биохимической» беременности у 40 (66,7%) женщин было подтверждено возрастанием уровня β-субъединицы ХГ в сыворотке крови более 20 МЕ/л на 14-й день после переноса эмбриона.
Образцы сыворотки крови и ФЖ у пациенток были взяты в день трансвагинальной пункции
яичников и аспирации фолликулов. После центрифугирования образцы хранились до исследования при -70 ˚C. В исследовании использовали образцы ФЖ, не содержащие примеси крови. Образцы сыворотки и ФЖ были проанализированы на наличие антител к гликопротеиновым (ХГ, ЛГ, ФСГ) и стероидным (ПГ, Э, Т) гормонам IgM и IgG классов с помощью описанных ранее методик иммуноферментного анализа – ИФА [1, 2]. Для определения антител на полистирольные микропланшеты иммобилизовали высокоочищенные препараты гонадотропинов человека посредством мышиных моноклональных антител к α-субъединице или стероидные гормоны, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich Co., США). Cыворотку крови
для исследования разводили 1:100, ФЖ – 1:10. Для выявления связавшихся антител использовали конъюгаты мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена против IgM, IgG человека (Sigma-Aldrich Co.). Оптическую плотность (ОП) измеряли на фотометре MULTISKAN
EX (Thermo Electron [Shanghai] Instruments Co., Китай) при длине волны 450 нм. Образцы исследовали в дублях однократно. Результат ИФА считали положительным, если средняя ОП исследуемого образца превышала более чем на три стандартных отклонения среднюю ОП контрольных образцов сыворотки крови здоровых фертильных женщин (n=30).
Cтатистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel раздела «Анализ данных» подраздела «Описательная статистика» и Statistika for Windows v. 7.0 (StatSoft Inc., США). Для сравнения средних величин и оценки степени достоверности различий между выборками рассчитывали критерий Стьюдента и χ², для выявления взаимосвязи нескольких переменных – коэффициент корреляции Пирсона или Спирмена. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Антитела к гормонам были выявлены в сыворотке крови и ФЖ у 37 (60%) пациенток с бесплодием (см. таблицу).
Таблица. Частота встречаемости антител (а) к гонадотропным (аХГ,аЛГ,аФСГ) и стероидным (аПГ, аЭ, аТ) гормонам в сыворотке крови и ФЖ.
Антитела к ХГ были обнаружены в сыворотке крови у 32 (53,3%) пациенток: IgM – у 19 (31,7%),
IgG – у 31 (51,7%); антитела к ПГ – у 27 (45%) пациенток: IgM – у 18 (30%), Ig G – у 26 (43,3%).
У 23 (38,3%) женщин были обнаружены антитела к обоим гормонам. Между уровнями IgG к ХГ
и ПГ была выявлена положительная корреляция средней силы (r=0,51; p<0,00003).
В контрольной группе антитела к ХГ были обнаружены в сыворотке крови у 9 (16,1%) женщин: IgM – у 6 (10,7%), IgG – у 4 (7,1%); антитела к ПГ – у 11 (19,6%) женщин: IgM – у 7 (12,5%), IgG – у 5 (8,9%). В исследуемой группе антитела к ХГ и ПГ в сыворотке крови выявлялись статистически значимо чаще, чем в контрольной группе (p<0,05).
В ФЖ у пациенток с бесплодием антитела к гормонам IgM класса не выявлялись. У 34 (56,7%)
пациенток были найдены только IgG: у 28 (46,7%) – к ХГ, у 24 (40%) – к ПГ. Уровень антител к гормонам в ФЖ был ниже, чем в сыворотке крови в 5–10 раз. У 4 (6,7%) женщин антитела к гормонам выявлялись только в сыворотке крови и не определялись в ФЖ. Между уровнями антител к ХГ и ПГ в сыворотке крови и ФЖ была найдена сильная корреляционная связь
(r=0,90, p<0,001 и r=0,88, p<0,001 соответственно). Выраженной корреляции между уровнями
антител к данным гормонам в ФЖ не наблюдалось.
В ФЖ были обнаружены также антитела, связывающиеся с другими гонадотропными (ЛГ
и ФСГ) и стероидными (Э и Т) гормонами (см. таблицу). Женщины имели различные профили антител по специфичности: у большинства женщин – 32 (86,5%) антитела связывались с несколькими гормонами одновременно, только у 5 (13,5%) – с одним гормоном (рис. 1, см. на вклейке).
У 28 (46,7%) женщин были обнаружены антитела, взаимодействующие с гонадотропными гормонами: у 28 (46,7%) – с ХГ, у 15 (25%) – с ЛГ, у 11 (18,3%) – с ФСГ, у 15 (25%) – одновременно с несколькими гонадотропными гормонами. Антитела к ХГ выявлялись статистически значимо чаще, чем к ЛГ и ФСГ (p=0,0134).
Антитела к стероидным гормонам были обнаружены у 36 (60%) женщин: к ПГ – у 24 (40%), к Э
– у 22 (36,7%), к Т – у 22 (36,7%), их сочетание – у 23 (38,3%) женщин. Антитела к трем стероидным гормонам были обнаружены у 8 (13,3%) женщин. Между уровнями антител к гонадотропным и стероидным гормонам выраженной корреляции не наблюдалось. Сильная корреляционная связь была выявлена между антителами к ЛГ и ФСГ (r=0,92, p<0,05), а также между антителами к Э и Т (r=0,83, p<0,05) (рис. 2). Корреляционная связь средней силы наблюдалась между антителами к ХГ и ЛГ (r=0,60, p<0,05), а также между антителами к ПГ и Э (r=0,53, p<0,05).
Рисунок 2. Корреляционная зависимость между уровнями аЛГ и аФСГ (а), аТ и аЭ (б) в ФЖ у пациенток с бесплодием, получающих лечение методом ЭКО при определении с помощью ЭФА.
Большинство женщин 45 (75%) имели ранее неэф фективные циклы ЭКО. У пациенток с неудачными попытками ЭКО в прошлом антитела к гормонам в ФЖ встречались чаще – у 30 (66,7%), чем у женщин, не получавших ранее лечения данным методом – у 7 (46,7%), а антитела к Э и Т – статистически значимо чаще: у 24 (53%) и у 2 (13,3%) соответственно (p=0,0088). Риск продукции антител к Э и Т у женщин, применявших ранее лечение методом ЭКО, был в 4 раза выше, чем у женщин без попыток ЭКО в анамнезе (относительный риск – ОР=4,0, 95% доверительный интервал – ДИ 1,07–14,96).
У пациенток с антителами к гормонам в ФЖ отрицательный результат в настоящем цикле ЭКО наблюдался статистически значимо чаще, чем у пациенток без антител: у 16 (43,2%) и 4 (17,4%) соответственно (p=0,0338). У пациенток с отрицательным результатом настоящей попытки ЭКО в ФЖ выявлялись антитела как к гонадотропным, так и стероидным гормонам (см. таблицу). Риск развития неблагоприятного исхода в цикле ЭКО у женщин с антителами к гормонам был в 2,5 раза выше, чем у женщин без антител (ОР=2,49, 95% ДИ 0,95–6,52).
Таким образом, у пациенток исследуемой группы были обнаружены аутоантитела к основным
гормонам репродуктивной системы, гонадотропным и стероидным, ответственным за рост фолликулов и созревание ооцитов, имплантацию эмбрионов и течение беременности на ранних сроках. Следует отметить, что частота встречаемости антител к ХГ и ПГ в сыворотке крови
в исследуемой группе была статистически значимо выше, чем в контрольной группе у фертильных женщин.
В ФЖ пациенток исследуемой группы были обнаружены антитела к гормонам IgG класса.
IgM не выявлялись, что, возможно, объясняется низким общим содержанием IgM в ФЖ и преобладанием в ней антител IgG и IgA классов [11]. Отмечалась сильная положительная корреляция между уровнями антител к ХГ и ПГ в сыворотке крови и ФЖ, что, по-видимому, свидетельствует о сывороточном происхождении антител к гормонам и поступлении их в ФЖ с транссудатом. Вследствие этого определение антител к гормонам в сыворотке крови позволяет судить о содержании их в ФЖ.
Запуску продукции антител могло способствовать применение высоких доз гонадотропных гормонов для стимуляции яичников, высокие нефизиологические концентрации Э и ПГ в лютеиновую фазу индуцированного цикла. Так, продукция Э в индуцированном цикле возрастает от 5 до 10 раз по сравнению с его уровнем в лютеиновую фазу спонтанного менструального цикла [9]. Превышение физиологических уровней гормонов выше критического порога может привести к стимуляции соответствующих аутоиммунных реакций [15]. Кроме того, сами эстрогены являются усилителями гуморального иммунитета и могут поддерживать аутоиммунитет, повышая дифференцировку B-клеток и продукцию антител путем активации T-клеток [9].
Антитела в ФЖ связывались не только с ХГ и ПГ, но и с другими гонадотропными и стероидными гормонами, в том числе с ФСГ, ЛГ и Э, необходимыми для роста фолликула и созревания ооцита. Женщины имели разные профили антител по специфичности: чаще в ФЖ встречались антитела к нескольким гонадотропным и/или стероидным гормонам одновременно,
реже – только к одному гормону. Сильная положительная корреляционная связь была выявлена
между антителами к ФСГ и ЛГ и между антителами к Э и Т, что, по-видимому, может объясняться
перекрестной реактивностью антител с близкими по антигенному строению гормонами. Как
известно, Т является предшественником Э при синтезе гормонов.
K. Haller и соавт. установили, что уровень антител (IgG, IgA) к ФСГ в ФЖ положительно
коррелирует с таковым в сыворотке крови и концентрацией ФСГ в ФЖ, а также возрастает с ростом фолликула [10]. По предположению авторов, антитела к ФСГ, связываясь с гормоном в фолликулах, противодействуют их росту.
M.A.R. Siddiqui и соавт. показали, что у животных присутствие антител к ХГ человека, нейтрализующих молекулы гормона, мешает проявлению эффектов ХГ, направленных на повышение кровотока в стенке фолликула, изменение гормонального профиля в ФЖ и плазме, улучшение созревания и качества ооцитов [13].
В исследуемой группе отмечался высокий риск продукции антител к гормонам у женщин, имевших в анамнезе попытки ЭКО. Полученные результаты совпадали с данными S.V. Shatavi и соавт., которые наблюдали наиболее высокую частоту встречаемости антител к гонадотропинам у женщин, получавших лечение гормональными препаратами [12].
У женщин с антителами к гормонам отмечался высокий риск развития неблагоприятного исхода в настоящем цикле ЭКО. При отрицательном результате выявлялись антитела к гонадотропным и стероидным гормонам, имеющим большое значение как для фолликулогенеза, так и для имплантации эмбриона. Наиболее часто обнаруживались антитела к ХГ и ПГ.
Как известно, нарушения имплантации могут возникать в результате пониженной рецептивности эндометрия [7]. ПГ определяет рецептивность, участвуя в экспрессии генов, ответственных за имплантацию на уровне эндометрия [3, 17]. Как было показано нами ранее, антитела к ПГ часто ассоциируются с гипоплазией эндометрия [1].
Секретируемый бластоцистой ХГ оказывает влияние на ее взаимодействие с эпителиальными клетками эндометрия и является промотором процессов имплантации [4]. F. Amato и соавт. выявили у женщины с нарушениями имплантации антитела к ХГ, которые обладали высокой связывающей способностью, достаточной, чтобы нейтрализовать максимальный сывороточный уровень гормона после введения препаратов ХГ [5]. Предполагается, что антитела к ХГ могут влиять на эффективность лечения бесплодия методом ЭКО.
Таким образом, у женщин с бесплодием, получающих лечение методом ЭКО, с высокой
частотой выявлялись аутоантитела к гонадотропным и стероидным гормонам в сыворотке
крови и ФЖ. При бесплодии антитела к гормонам встречались в сыворотке крови значительно чаще, чем у фертильных женщин. Антитела к гормонам в ФЖ встречались преимущественно у женщин с неэффективными попытками ЭКО. У женщин с антителами к гормонам значительно чаще наблюдался отрицательный результат в настоящем цикле ЭКО.
Аутоантитела к гонадотропным и стероидным гормонам могут рассматриваться как возможный
фактор риска неблагоприятных исходов в циклах ЭКО. Для подтверждения данной гипотезы
необходимо проведение дальнейших научных исследований.
