Своевременное выявление плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL— англ. Squamous intraepithelial lesions) является крайне важным для снижения заболеваемости и смертности от рака шейки матки [4, 8, 13]. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость усовершенствования интерпретации результатов цитологического исследования и биопсии патологически измененной шейки матки. Несмотря на морфологические критерии, позволяющие определить тяжесть предраковых состояний шейки матки, нередко возникают трудности в их диагностике [5, 15]. Вместе с тем для проведения адекватной терапии в гистологическом заключении должна быть отражена сущность патологических изменений шейки матки, позволяющая предположить клиническое течение поражения. Как известно, SIL низкой степени со структурны-ми особенностями легкой дисплазии (CIN1) у 57% женщин подвергаются регрессии и лишь у 1% больных в последующем диагностируется инвазивная плоскоклеточная карцинома, тогда как при SIL высокой степени с признаками тяжелой дисплазии и карциномы in situ (CIN3) преимущественно отмечается персистенция поражения (у 56%), а у 12% женщин — развитие инвазивной карциномы. К сожалению, на основании морфологических критериев высказать суждение о биологической сущности поражения и как следствие о течении SIL не представляется возможным.
В настоящее время для повышения качества диагностики, определения индивидуального прогноза течения поражения шейки матки и обоснованного проведения лечебных мероприятий большое внимание уделяется иммуногистохимическому исследованию экспрессии биомаркеров в тканях пораженной шейки матки [14, 22, 25]. Одним из таких биомаркеров считается антиген Ki-67, определение экспрессии которого применяется для отличия SIL от неизмененного эпителия и его доброкачественных реактивных поражений [21, 26], другим — протеин р16INK4a, являющийся ингибитором циклинзависимых киназ CDk4 и CDk6, повышенная экспрессия которого связана с инфицированием вирусом папилломы человека (ВПЧ) [2, 19, 27].
Цель исследования состояла в изучении экспрессии Ki-67 и р16INK4a в ткани неизмененной и патологически измененной шейки матки и возможности использования данных биомаркеров в качестве факторов, определяющих индивидуальный прогноз течения патологического процесса.
Материал и методы исследования
Материалом для исследования служили биоптаты шейки матки 377 женщин, среди которых SIL разной степени тяжести были диагностированы у 53 больных. Последние были разделены на 2 группы. В 1-ю группу (SIL низкой степени) были включены 25 больных в возрасте от 18 до 27 лет (средний возраст 23±2,3 года), в биопсийной ткани которых патологические особенности эпителия шейки матки соответствовали плоской кондиломе и ее сочетанию с легкой дисплазией (CIN1), во 2-ю группу (SIL высокой степени) — 28 больных в возрасте от 25 до 34 лет (средний возраст 28,5±4,7 года), в биоптатах шейки матки которых структурные особенности соответствовали умеренной и тяжелой дисплазии и карциноме in situ (CIN2, CIN2-3, CIN3). Дополнительно были выделены группы сравнения: 11 больных в возрасте от 27 до 37 лет (средний возраст 32,9±4,1 года) с инвазивной плоскоклеточной карциномой (3-я группа) и 9 женщин в возрасте 22-35 лет (средний возраст 27,7±5,6 года) с неизмененным многослойным плоским эпителием (4-я группа).
Иммуногистохимическое исследование проводили на депарафиновых срезах толщиной 4 мкм с использованием моноклональных мышиных антител к ядерному антигену делящихся клеток Кi-67 (1:500, клон MIB-1) и диагностического набора р16INK4a -kit (1:400, Dako, Дания). В качестве демаскирующего приема применяли нагревание стекол со срезами в трисбуфере в водяной бане при 98˚C в течение 30 мин. Эндогенная пероксидаза была блокирована с помощью инкубации срезов с 3% перекисью водорода (15 мин). Специфическое связывание выявляли с помощью вторичных кроличьих антител фирмы Labvision. Специфическое окрашивание проводили диаминобензидином (DAB, Dako, Дания). Срезы докрашивали гематоксилином. В каждом случае применяли позитивный и негативный контроль исследования.
Анализ изображения и фотодокументацию проводили с использованием программного обеспечения фирмы Karl Zeiss (Германия). Специфическое иммуногистохимическое окрашивание идентифицировали на основании коричневого окрашивания ядер. В каждом срезе в 10 полях зрения при увеличении ×400 микроскопа Axioplan II (Karl Zeiss, Германия), что соответствует площади 1 мм2, определяли число окрашенных клеток и общее число клеток в эпителиальном пласте. Пролиферативную активность эпителия шейки матки рассчитывали на основании числа ядер эпителия с экспрессией Ki-67 на 100 клеток (при учете не менее 500 клеток) и выражали в процентах. Экспрессию р16INK4a выражали в баллах методом, учитывающим процент клеток с позитивным окрашиванием и интенсивность последнего [10].
При определении достоверности различий экспрессии Ki-67 и р16INK4a в эпителии шейки матки использовали критерий Вилкоксона–Манна–Уитни [3].
Результаты исследования и обсуждение
Показатели экспрессии Ki-67 в эпителии шейки матки представлены на рис.1.
Статистически достоверные различия в экспрессии Ki-67 между неизмененным эпителием и SIL низкой степени и между последней и SIL высокой степени отсутствовали. Достоверные различия в отношении биомаркера пролиферации обнаружены между неизмененным плоским многослойным эпителием шейки матки и SIL высокой степени, а также плоскоклеточной карциномой (р<0,5). Необходимо отметить, что в неизмененном эпителии шейки матки экспрессия Ki-67 определялась в парабазальном слое (в 12 образцах), тогда как при SIL низкой и высокой степени — в промежуточном и поверхностном отделах эпителиального пласта. Экспрессию в нижней трети эпителиального пласта наблюдали в 4 образцах SIL низкой степени (рис. 2 см. на вклейке), локализацию в пределах нижних 2/3 эпителия — в 5 образцах SIL высокой степени. Экспрессия Ki-67 в SIL высокой степени отличалась некоторой вариабельностью и наблюдалась в пределах половины эпителиального пласта, у других — и в поверхностном отделе последнего (рис. 3 см. на вклейке). В раковых поражениях шейки матки экспрессия Ki-67 была характерна для всех клеток опухоли.
Экспрессия р16INK4a в эпителиальных пластах неизмененной шейки матки не наблюдалась. Она отмечалась только в клетках эпителия патологически измененной шейки матки (рис. 4), притом различия в отношении данного биомаркера между SIL низкой и высокой степени не были статистически значимыми.
Достоверные различия в экспрессии р16INK4a обнаружены между SIL низкой степени, а также SIL высокой степени и плоскоклеточной карциномой шейки матки. Следует отметить, что в 3 образцах SIL низкой степени (рис. 5 см. на вклейке) и в 5 образцах SIL высокой степени экспрессия р16INK4a отмечалась в нижней трети эпителиального пласта. Экспрессия р16INK4a определялась в промежуточном и поверхностном слоях эпителия в 14 образцах SIL низкой степени и 31 образце SIL высокой степени тяжести (рис. 6 см. на вклейке); в плоскоклеточной карциноме экспрессия данного биомаркера выявлена на протяжении всей опухоли в 11 образцах и отсутствовала в 1 образце.
При сопоставлении экспрессии обоих биомаркеров у 7 из 25 женщин 1-й группы с морфологической картиной плоской кондиломы и CIN1 отмечалась низкая экспрессия р16INK4a, а экспрессия Ki-67 мало отличалась от таковой в неизмененном эпителии шейки матки. У 9 женщин данной группы также с низкой экспрессией р16INK4a в эпителиальных клетках шейки матки наблюдали высокую экспрессию Ki-67, которая может быть связана с реактивными доброкачественными изменениями эпителия. У остальных 9 женщин 1-й группы экспрессия и р16INK4a, и Ki-67 была высокой и позволяла предположить прогрессирование патологического процесса.
Во 2-й группе у 8 из 28 женщин в шейке матки со структурными особенностями CIN2-3 экспрессия р16INK4a и Ki-67 почти совпадала с показателями данных биомаркеров в эпителии шейки матки при SIL низкой степени. Более высокая экспрессия биомаркеров наблюдалась в эпителии шейки матки остальных 20 женщин этой группы, притом у 4 из них с изменениями эпителия шейки матки, которые соответствовали плоскоклеточной карциноме in situ, экспрессия Ki-67 и р16INK4a приближалась к показателям, свойственным инвазивным поражениям.
Микроскопические особенности SIL отражают баланс между факторами, способствующими прогрессированию патологического процесса и оказывающими ингибирующие воздействие на его развитие. Степень тяжести патологического процесса, определенная стандартным методом, т.е. при гистологическом исследовании биопсийной ткани шейки матки, во многом определяет лечебные мероприятия. Однако при гистологическом исследовании биопсийной ткани шейки матки иногда сложно провести дифференциальную диагностику между SIL низкой степени тяжести и доброкачественными изменениями эпителия. Кроме того, в некоторых случаях при расположении патологического процесса в промежуточном слое многослойного плоского эпителия возникают трудности в определении не только сущности, но и тяжести патологического процесса [15]. Низкая воспроизводимость диагностирования CIN, особенно CIN2, и невозможность предсказания течения поражения на основании морфологического исследования способствовали применению при исследовании SIL иммуногистохимических методов, особенно для определения биомаркеров Ki-67 и р16INK4a [1, 2, 6].
Антиген Ki-67 является ядерным протеином, экспрессия которого отмечается в активные фазы клеточного цикла (G1, S, G2 и митоз) и отсутствует во время покоя (G0). Экспрессия Ki-67 в SIL отличается от таковой в неизмененном многослойном плоском эпителии шейки матки, которому свойственно расположение Ki-67-позитивных клеток в парабазальном слое [21]. Согласно данным литературы, при SIL Ki-67-позитивные клетки определяются в промежуточном и поверхностном слоях эпителия, что позволяет использовать данный маркер для разграничения степени тяжести патологического процесса [20]. Результаты нашего исследования также свидетельствуют, что по мере прогрессирования патологического процесса экспрессия Ki-67 повышается. Другими словами, определение экспрессии Ki-67 способствует более точной оценке степени тяжести поражения. Вместе с тем следует отметить, что при SIL высокой степени (CIN2, CIN2-3, CIN3) отмечалась вариабельность экспрессии Ki-67. Подобная вариабельность экспрессии данного биомаркера указывает на субъективную оценку CIN2 и CIN3 при морфологическом исследовании биопсийной ткани, и, возможно, более целесообразно их объединение и выделение SIL двух степеней тяжести. Следует отметить, что экспрессия Ki-67 не специфична для цервикальной неоплазии или папилломавирусной инфекции, поскольку может быть обусловлена воспалением, при котором усиливается клеточная пролиферация и реактивная плоскоклеточная метаплазия [17].
Полученные нами и приведенные в литературе данные свидетельствуют о необходимости определения экспрессии р16INK4a для оценки степени тяжести SIL. Учитывая, что инактивация рRb онкопротеином Е7 ВПЧ приводит к усилению экспрессии протеина р16INK4a, которая регулируется по типу отрицательной обратной связи, повышенная экспрессия этого биомаркера свидетельствует о поражении, обусловленном ВПЧ [19, 27]. Информация о наличии ВПЧ не имеет диагностического значения, поскольку ВПЧ можно обнаружить и при отсутствии патологических изменений шейки матки [6].
Согласно нашим наблюдениям и данным литературы, суперэкспрессия р16INK4a, т.е. диффузное и интенсивное окрашивание, преобладает при цервикальном раке и SIL высокой степени, а слабое очаговое окрашивание — при SIL низкой степени. Кроме того, экспрессия р16INK4a способствовала разграничению патологически измененного участка от прилежащего неизмененного эпителия и стромы шейки матки. Для SIL высокой степени и рака шейки матки было свойственно окрашивание не только ядер клеток, но и цитоплазмы, в то время как при SIL низкой степени окрашивались преимущественно ядра, что совпадает с результатами других исследователей [18, 28]. Можно предположить, что большее число клеток с экспрессией р16INK4a, а также более интенсивное окрашивание при SIL низкой степени свидетельствуют об инфицировании ВПЧ высокого риска, а также большей вирусной нагрузке, учитывая связь между последней и риском развития рака [8, 9]. Поскольку цервикальный канцерогенез связан с интеграцией ВПЧ в ДНК клетки хозяина, а вероятность интеграции увеличивается с повышением вирусной нагрузки [23], нельзя исключить, что диффузная экспрессия р16INK4a в клетках эпителия при SIL низкой степени сопряжена с большей вирусной нагрузкой и вероятностью интеграции ВПЧ с большим риском развития SIL высокой степени [23, 24].
Отсутствие или слабая экспрессия р16INK4a в SIL низкой степени, по-видимому, обусловлены сравнительно низкой аффинностью Е7 низкоонкогенных типов ВПЧ к рRb, из-за которой, возможно, не происходит суперэкспрессии р16INK4a [24]. Кроме того, в некоторых солидных опухолях отмечаются мутация гена р16, делеция и гиперметилирование его промотера, подавляющих экспрессию р16INK4a [7, 12, 16] Указывается также, что многократное усиление транскрипции гена, кодирующего р16 под воздействием ВПЧ, по-видимому, является не единственным механизмом развития цервикального рака, так как указывается на отсутствие данного онкопротеина в части инвазивных раковых поражений шейки матки [1]. Кроме того, ВПЧ может быть инактивирован иммунными клетками хозяина, инфицирование может быть недавним, а вирус — дефективным [11, 24]. Во всех этих случаях транскрипция Е6 и Е7 не приводит к суперэкспрессии р16INK4a.
Следует отметить, что низкая экспрессия Ki-67 при отсутствии экспрессии р16INK4a при SIL низкой степени, вероятно, свидетельствует о наличии метапластических изменений в эпителии.
Таким образом, сочетанное определение Ki-67 и р16INK4a способствует более полноценному определению биологической сущности патологического процесса в эпителии шейки матки. Иммуногистохимическое исследование данных маркеров поможет не только более качественной диагностике поражения, но и выбору необходимого объема лечебных мероприятий.
