Possibilities of predicting the outcomes of assisted reproductive technologies from sperm mRNA levels

Smolnikova V.Yu., Krasnoshchoka O.E., Burmenskaya O.V., Trofimov D.Yu., Kalinina E.A., Sukhikh G.T.

Academician V. I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Objective: to determine a correlation between the expression of sperm protamine type 1 and 2 (PRM-1 and PRM-2), fertiline-β (ADAM-2) mRNA, and the outcomes of treatment for infertility in the use of assisted reproductive technologies (ART).
Material and methods. Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction was used to study the PRM-1, PRM-2, and ADAM-2 gene mRNA profile in 79 married couples with different results of in vitro fertilization and embryo transfer ((IVF-ET) treatment for infertility. Of them, 13 couples had a successful outcome of the IVF and ET program; 66 couples had an unsuccessful outcome (10 couples with spontaneous miscarriage before 11 weeks gestation, 19 couples with biochemical pregnancy, and 37couples with failed IVF-ET). The clinical pregnancy rate with reference to ET was 29.1% (23/79).
Results. The expression of ADAM-2 mRNA was shown to be significantly decreased in the biochemical pregnancy and failed IVF groups as compared to the control one. In addition, that of PRM-1 and PRM-2 was less in the biochemical pregnancy group as compared to the control group.
Conclusion. To study a role of sperm mRNA in the prediction of the outcome of ART programs is promising for the investigation of a parental contribution to embryo development. The poor prognosis of ART programs is associated with the decreased expression of the ADAM-2, PRM-1, and PRM-2 mRNA genes.

Keywords

PRM-1 PRM-2
ADAM-2

Возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)
во всем мире обусловлен приоритетностью проблемы бесплодия. Современные подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар основаны на достижениях фундаментальной
науки в области изучения молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации
процесса репродукции у человека.

Способность эмбриона к успешной имплантации определяется различными факторами, зависит от условий формирования исходного статуса гамет, стабильности организации их генетического материала, строгой временнóй последовательности структурных внутриклеточных процессов [4, 7].

С тех пор как S.M. Wykes и соавт. в 1997 г. первыми опубликовали данные о существовании
нескольких видов мРНК в зрелом сперматозоиде человека, отцовский вклад в оплодотворение
и развитие эмбриона стал важным предметом исследований [5, 11, 19].

В течение последних 15 лет определены различные подгруппы популяций мРНК. Транскриптом
сперматозоида содержит более 400 видов мРНК, роль которых в процессе сперматогенеза и раннего эмбриогенеза остается недостаточно изученной [4, 5]. Имеются данные, что сперматозоид
может передавать эти мРНК ооциту при оплодотворении, что доказано на моделях мышей
и у человека [4, 5, 14]. В литературе также есть указания на то, что спермальные мРНК обладают структурной функцией в связи с тем, что они составляют часть ядерного матрикса, располагаясь по периферии ядра близко к ядерной мембране [7, 14, 15].

В процессе сперматогенеза происходит ремоделирование хроматина. На постмейотической
гаплоидной стадии сперматогенеза происходит замещение гистонов и гистоноподобных белков,
упаковывающих ДНК протаминами через ряд транзиторных белков [1, 2]. Протамины принадлежат к небольшим ядерным протеинам.

В результате участия протаминов в организации ядерного матрикса головки сперматозоида хроматин становится транскрипционно неактивным вследствие высокой конденсации ДНК. В работах последних лет была показана связь между количеством транскриптов протаминов, концентрацией протаминов, подвижностью сперматозоидов и способностью к оплодотворению [5,
10, 11, 17]. Дефицит протаминов может являться результатом дисфункции транскрипции и трансляции в течение сперматогенеза [4].

Немаловажным для исхода программ ВРТ является также пенетрационная способность сперматозоида. Ключевую роль в процессе взаимодействия сперматозоида и ооцита играют белки семей ства
интегральных мембранных протеинов ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase), известных также
как фертилин-α (ADAM-1) и фертилин-β (ADAM-2) [8, 13, 18]. Эти белки локализуются в экваториальной области головки сперматозоида, а растворимые домены фертилинов могут связываться с микроворсинчатым регионом ооцита. Учитывая данные британских исследователей о том, что у человека ген фертилина-α неактивен и является псевдогеном, предметом нашего изучения явилась экспрессия мРНК фертилина-β [9]. Фертилин-β может потенцировать связывание головки сперматозоида и способствовать слиянию гамет [3]. Однако окончательная роль и вклад фертилина-β в формирование зиготы и развитие эмбриона до сих пор остаются неизвестными.

Таким образом, профиль мРНК может иметь значение для развития сперматозоида и раннего
эмбриогенеза. Литературные данные о геномном и эпигеномном наследовании у человека
позволяют сделать заключение о потенциальной важности «отцовского вклада» не только для
оплодотворения ооцита, но и для раннего развития эмбриона, а также возможности использования этих данных для усовершенствования программ ВРТ. Разработка неинвазивных методов для определения качества сперматозоидов в прогнозировании развития эмбриона с хорошим имплантационным потенциалом позволит оптимизировать программы ВРТ.

В связи с этим цель настоящего исследования состояла в определении связи между уровнями экспрессии мРНК протаминов 1 и 2 типов (PRM-1 и PRM-2), фертилина-β (ADAM-2) и исходами лечения бесплодия при использовании ВРТ.

Материал и методы исследования

С целью определения взаимосвязи уровней экспрессии спермальных мРНК генов PRM-1,
PRM-2, ADAM-2 и исхода программ ВРТ было проведено исследование спермы у 79 мужчин,
включенных в исследование и участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения
и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ). Критериями включения пар в исследование служили: трубно-перитонеальный фактор бесплодия, возраст пациентки не более 37 лет, число предшествующих циклов ЭКО и ПЭ не более 2, нормальный овариальный резерв. Критериями исключения
явились – наличие уровня фолликулостимулирующего гормона в начале менструального цикла
более 12 мМЕ/мл, эндометриоз II–IV степеней распространения, миома матки больших размеров,
синдром поликистозных яичников, олигоастенотератозооспермия III–IV степеней. Стимуляция
суперовуляции проводилась по стандартному «длинному» протоколу. Перенос 1 или 2 эмбрионов в полость матки проводился на 3-и и/или 5-е сут дробления.

Разделение исследуемых пациентов на группы было произведено с учетом данных европейской группы мониторинга исходов ВРТ (EIM ESHRE, 2007). Были выделены две группы супружеских
пар успешного (I группа) и неуспешного исходов программы ЭКО и ПЭ (II группа). В I группу (контроля) были включены пациенты с благополучным результатом лечения бесплодия, что привело к рождению здорового ребенка (n=13). Исследуемые пациенты с неуспешным завершением ЭКО и ПЭ были распределены в 3 подгруппы. У пациенток подгруппы IIa беременность наступила, но закончилась самопроизвольным выкидышем до 11 нед (n=10). Подгруппу IIb составили пациентки с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными (уровень β-субъединицы хорионического гонадотропина составлял не менее 30 мМЕ/мл на 14-й
день после переноса эмбрионов), так называемые «преэмбрионические потери» (n=19). К IIс подгруппе были отнесены пациентки с отрицательным исходом ЭКО и ПЭ, уровень β-субъединицы
хорионического гонадотропина составлял менее 20 мМЕ/мл (n=37). Всего беременность наступила
у 23 пациенток из 79 исследуемых пар. Частота наступления клинической беременности в расчете
на ПЭ составила 29,1%.

Для исследования образцы нативной спермы были отобраны в день трансвагинальной пункции в отдельные пробирки в объеме 200 мкл. Исследование профиля мРНК генов PRM-1, PRM-2 и ADAM-2 проводили методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Уровень экспрессии оценивали методом ΔΔCq, сравнивая нормированные
значения пороговых циклов исследуемых генов. Нормировку проводили относительно референсных генов HPRT1, TBP и B2М. За 1 было принято значение медианы (Ме) в контрольной группе.

При статистической обработке данных в качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана, а в качестве интервальной оценки – верхнюю и нижнюю
квартили. Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна-
Уитни.

Результаты исследования

В результате проведенного исследования было показано, что при неуспешном исходе программы ЭКО и ПЭ определялось достоверное снижение уровня экспрессии мРНК фертилина-β (ADAM-2) в нативной сперме. При этом в подгруппе IIb уровень снизился в 6,3 раза (Me=0,16, p=0,002), а в подгруппе IIc – в 2,6 раза (Ме=0,38, p=0,012) относительно контрольной группы (табл. 1). Аналогичная тенденция к снижению уровня экспрессии ADAM-2 прослеживалась и в IIa подгруппе – в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой (р=0,077).

Таблица. Уровень экспрессии мРНК в группах, Me (L-H).

При анализе различий уровней экспрессии мРНК фертилина-β между контрольной группой
и II группой в целом, выявлено статистически значимое снижение экспрессии фертилина-β
в 2,6 раза в группе II (p=0,003).

Для мРНК протаминов получены значимые различия между I и IIb группами: уровень экспрессии мРНК гена PRM-1 был в 3,7 раза меньше (p=0,023), а уровень экспрессии мРНК гена
PRM-2 был в 7,1 раза меньше (p=0,008) по сравнению с группой контроля. Аналогичная тенденция
к снижению уровня экспрессии PRM1 и PRM2 прослеживалась и в IIc подгруппе с неуспешным
исходом ЭКО и ПЭ соответственно в 1,2 раза и 1,9 раза по сравнению с контрольной группой
(соответственно р=0,13 и р=0,15). Достоверных различий и тенденции к снижению уровня экспрессии мРНК PRM1 и PRM2 в IIa подгруппе с самопроизвольными выкидышами по сравнению с контрольной группой не выявлено.

Обсуждение

В работе были рассмотрены наиболее важные и хорошо изученные спермальные мРНК
(ADAM-2, PRM-1, PRM-2). ADAM-2, или фертилин-β, играет ключевую роль в слиянии
гамет. Комплексом распознавания фертилина-β служит трипептид FEE (фенилаланин-глутамин-глутамин) в оолемме ооцита [5].

Основная функция протаминов сводится к упаковке и компактизации спермальной ДНК
в сперматозоидах в процессе ремоделирования хроматина. Биологический смысл ремоделирования состоит в том, чтобы отцовский генетический материал был доставлен без риска повреждения молекул ДНК извне, наиболее компактно. В результате конденсации хроматина транскрипционные процессы в сперматозоиде замедляются. Изменение количества протаминов приводит к неадекватной компактизации хроматина, нарушению структурной целостности ДНК. При проведении программ ВРТ сперматозоиды со значительным уровнем фрагментации ДНК сохраняют способность оплодотворять ооциты, однако в дальнейшем эмбриональное развитие может блокироваться на разных этапах.

Степень конденсации хроматина влияет не только на качество спермы, но и на раннее развитие эмбриона. В работах M.J. D’Occhio. и соавт. выявлена значимая корреляция степени конденсации хроматина с выживаемостью эмбриона на ранних стадиях развития [6]. Это может быть связано с тем, что протамины принимают участие во взаимодействии материнского и отцовского геномов и организации упаковки хромосом при первом делении зиготы и последущих первых делениях эмбриона.

Если ранее, до открытия спермальных мРНК, считалось, что качество эмбриона определяется в основном состоянием и степенью «зрелости» ооцита, а роль сперматозоида состоит лишь
в доставке ДНК, то в настоящее время все бóльшее внимание уделяется влиянию мужского фактора
на процессы раннего развития [7, 16, 20]. В настоящее время предполагают, что «отцовский вклад»
в развитие эмбриона состоит не только в доставке и предоставлении генетического материала,
но включает и доставку спермальных мРНК [12]. Активация собственного генома у человеческого
эмбриона происходит, начиная со стадии 8 бластомеров, то есть через 72 ч после оплодотворения. Транскрипты хранятся в цитоплазме задолго до того, как потребуется реализовать процесс трансляции и получить необходимые молекулы белка [12]. Ранее функцию запасания транскриптов для раннего эмбриона отводили исключительно ооциту. Фактически первые 72 ч своего развития эмбрион использует транскрипты, запасенные в гаметах, бóльшей частью – в ооцитах. Демонстрация процесса передачи транскриптов от сперматозоида к ооциту при оплодотворении поддерживает гипотезу об участии спермальных мРНК в развитии зиготы и эмбриона [14].

В результате работы получены данные о негативном влиянии пониженного уровня мРНК протаминов и фертилина-β на исход программы ВРТ, что согласуется с данными M. Depa-Martynow
и соавт. (2007) и B. Kempisty и соавт. (2006) [5, 10]. Однако в нашем исследовании не выявлено столь существенного снижения количества мРНК протаминов и фертилина-β в сперме при неудачах программы ЭКО. По-видимому, это связано с тем, что успешный исход ЭКО и ПЭ
определяется не только изученными факторами, но и другими параметрами, такими как физиологический статус женщины, качество ооцита и переносимых эмбрионов, состояние эндометрия, течение беременности, сопутствующей патологии и др.

Обращает на себя внимание и то, что низкий уровень экспрессии мРНК исследуемых генов
ассоциирован с потерей эмбриона на ранних стадиях развития (биохимическая беременность)
или отсутствием беременности (группы IIb и IIc). Это соответствует современным представлениям
о роли спермальных мРНК в обеспечении основных функций сперматозоида и их участии в раннем эмбриогенезе на преимплантационных и имплантационных стадиях развития. Время полужизни мРНК составляет от 5 до 72 ч, то есть до активации собственного генома эмбриона, достигшего стадии 8 бластомеров. Неблагоприятный прогноз программ ВРТ ассоциирован с уменьшением экспрессии мРНК генов ADAM-2, PRM-1 и PRM-2.

Таким образом, определение экспрессии спермальных мРНК для прогнозирования исхода
программ ВРТ представляется целевым направлением изучения отцовского вклада в развитие
эмбриона. В будущем морфологическая характеристика гамет, скорее всего, будет сопровождаться данными об их молекулярном профиле. Исследование роли спермальных транскриптов в процессе оплодотворения на этапе формирования зиготы и стадии раннего дробления является перспективной областью в углубленной диагностике мужского фактора бесплодия и требует дальнейшего детального анализа.

References

1. Bauer M., Patzelt D. Protamine mRNA as molecular marker for spermatozoa in semen stains// Int J Legal Med. – 2003. – Vol. 117. – P. 175–179.
2. Carreau S., Lambard S., Said L. et al. RNA dynamics of fertile and infertile spermatozoa//Mol. Reprod. Dev. – 2010. – Vol. 77. – P.158–166.
3. Cho C., Bounch D.O., Faure J.E. et al. Fertilization defects in sperm mice lacking fertilin beta// Science. – 1998. – Vol. 281. – P.1857–1859.
4. Dadoune J.-P. Spermatozoal RNAs: What about their functions?// Microscopy Res.Techn. – 2009. – Vol. 72. – P. 536–551.
5. Depa-Martynów M., Kempisty B., Lianeri M. et. al. Association between fertilin -β, protamines 1 and 2 and spermatid-specific linker histone H1-like protein mRNA levels, fertilization ability of human spermatozoa and quality of preimplantation embryos// Folia Histochem. Cytobiol. – 2007. – Vol. 45. – P. 79–85.
6. D'Occhio M.J., Hengstberger K.J., Johnston S.D. Biology of sperm chromatin structure and relationship to male fertility and embryonic survival// Anim. Reprod. Sci. – 2007. – Vol.101. – P.1-17.
7. Douglas T.C., Hammoud S.S. The human sperm epigenome and its potential role in embryonic development// Mol. Hum. Reprod. – 2010. –Vol.16, №.1. – P. 37–47.
8. Emery B.R., Carrell D.T. The effect of epigenetic sperm abnormalities on early embryogenesis// Asian J. Androl. - 2006. - Vol. 8. – P.131–142.
9. Jury J.A., Frayne J., Hall L. The human fertilin a gene is non-functional: implications for its proposed role in fertilization// Biochem. J. – 1997. – Vol. 321. – P. 577 –581.
10. Kempisty B., Jedrzejczak P., Jagodzinski P.P. Structure and role of protamines 1 and 2 in spermatogenesis and male infertility// Ginek. Pol. – 2006. – Vol. 77. – P. 238–245.
11. Kempisty B., Depa-Martynow M., Lianeri M. et al. Evaluation of protamines 1 and 2 transcript contents in spermatozoa from asthenozoospermic men// Folia Histochem. Cytobiol. – 2007. - Vol. 45. – P.109-113.
12. Krawetz S.A. Paternal contribution: new insights and future challenges// Nat. Rev.: Genet. – 2005. – Vol.6. – P. 633-642.
13. Menezo Y.J. Paternal and maternal factors in preimplantation embryogenesis: interaction with the biochemical environment//Reprod. Biomed. Online. - 2006. – Vol.12. – P.616-621.
14. Miller D., Ostermeier C.G., Krawetz S.A. The controversy, potential and roles of spermatozoal RNA// Trends Mol. Med. – 2005. – Vol.11, № 4. – P.156–163.
15. Miller D., Brinkworth M., Iles D. Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? DNA, histones, protamines and epigenetics// Reproduction. – 2010. – Vol. 139. – P. 287–301
16. O’Flynn K.L., O’Brien B.A., Varghese A.C., Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: A review//Fertil. and Steril. – 2010. – Vol. 93, № 1. – P. 1–12.
17. Steger K., Pauls K., Klonisch T. et al. Expression of protamine-1 and -2 mRNA during human spermiogenesis// Mol Hum Reprod. – 2000. – Vol. 6. – P. 219–225.
18. Tesarik J. Paternal effects on cell division in the human preimplantation embryo// Reprod. Biomed. Online. – 2005. – Vol.10. – P.370-375.
19. Zhao C., Guo X.-J., Shi Z.-H. et al. Role of translation by mitochondrial-type ribosomes during sperm capacitation: An analysis based on a proteomic approach// Proteomics. – 2009. – Vol. 9. – P.1385–1399.
20. Zhao Y., Li Q., Yao C. et al. Characterization and quantification of mRNA transcripts in ejaculated spermatozoa of fertile men by serial analysis of gene expression//Hum. Reprod. – 2006. – Vol.21, № 6. – P. 1583–1590.

About the Authors

SMOLNIKOVA Veronika Yuryevna, Leading Researcher, Department for Assistive Technologies in Infertility Treatment, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-25-01
E-mail: v_smolnikova@oparina4.ru

KRASNOSHCHOKA Olga Evgenyevna, Postgraduate, Department for Assistive Technologies in Infertility Treatment, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-25-01
E-mail: mydiss@mail.ru

BURMENSKAYA Olga Vladimirovna, Researcher, Laboratory of Molecular Genetic Methods, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-22-92
E-mail: o_burmenskaya@oparina4.ru

TROFIMOV Dmitri Yuryevich, Head, Laboratory of Molecular Genetic Methods, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-49-51
E-mail: d_trofimov@oparina4.ru

KALININA Elena Anatolyevna, MD, Head, Department for Assistive Technologies in Infertility Treatment, Academician V. I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-13-41
E-mail: e_kalinina@oparina4.ru

Professor SUKHIKH Gennady Tikhonovich, MD, Academician of the Russian Academy of Medical Sciences, Director, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Address: 4, Oparin St., Moscow 117997
Telephone: 8 (495) 438-18-00
E-mail: g_sukhikh@oparina4.ru
By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.