Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) – один из наиболее универсальных и широко используемых методов исследования протеомов биологических систем. Этот метод имеет явные преимущества в разделении и идентификации тысяч отдельных видов белков, включая изоформы и посттрансляционные модификации. Однако он также имеет и недостатки, основанные на молекулярной диффузии и конвекции. Альтернативой является разделение в капиллярах, которые обладают низкой проводимостью, генерируют небольшое количество тепла и антиконвективны.
Цель настоящей работы – сравнение технологий электрофоретического разделения белков в ПААГ и в капиллярах. Мы исследовали и сравнили протеомный состав естественных киллеров линии NK-92 и микровезикул (МВ), продуцируемых ими при спонтанном культивировании и активации IL-1β с помощью двух этих методик.
Спонтанно культивируемые или активированные IL-1β клетки линии NK-92 и продуцируемые ими МВ разделяли путем последовательного центрифугирования (200 g, 9900 g, 19 800 g). Пробы гомогенизировали в воде, полученный материал центрифугировали (16 000 g), а полученный супернатант анализировали методом капиллярного электрофореза на микрочипе High Sensitivity Protein Chip 250 (Agilent Technologies, США) с помощью биоанализатора Agilent 2100. Аналогично готовили пробы для электрофореза в ПААГ, но после центрифугирования из супернатанта выпаривали воду и растворяли пробы в буфере RIPA (50 мМ Трис-HCl pH 8,1; 1% Тритон Х-100; 0,1% додецилсульфат натрия; 0,5% дезоксихлорат натрия; 1мМ ЭДТА; 150 мМ NaCl). Также в буфере RIPA растворяли осадки для дополнительного извлечения мембранных белков. Пробы подвергали одномерному электрофорезу в камере Mini-Protean TGX™ Stain-Free PrecastGel (Bio-Rad Laboratories, США). Результаты электрофореза обрабатывали в программе Image Lab (Bio-Rad Laboratories, США). Статистический анализ полученных данных (n=3–6) проводили при помощи непараметрического критерия Манна–Уитни.
Группы белков различных масс (kDa) и количество белка в этих группах (%) в пробах были исследованы с помощью двух видов электрофореза. Анализ результатов показал, что активированные и неактивированные клетки содержат больше (9–16) групп белков по массе (>3% от относительного количества белка), чем их МВ (5–10 групп). Метод гель-электрофореза, в отличие от чипов, позволяет исследовать как цитоплазматические (гидрофильные), так и мембранные (липофильные) белки. Суммарно в клетках гель-электрофорезом было выделено 16 групп белков, 4 из которых были представлены только в гидрофильной или липофильной фракции (p<0,05). В то же время электрофорезом на чипах в клетках было обнаружено 12 групп белков. Белки МВ разделялись гель-электрофорезом на 7 групп в каждой из двух фракций (матриксные и мембранные белки), и только 4 из них были общими для обеих фракций. На микрочипах в МВ было определено 6 групп белков.
Оценка одномерных гелей выявила часть общих групп для клеток и их МВ: среди цитоплазматических белков совпадали 4 группы (из 11 в клетках и из 7 в МВ), а среди мембранных – 5 групп (из 12 в клетках и из 7 в МВ) (p<0,05). Группы белков по массе, исследованные на микрочипах, в клетках и МВ не совпадали.
Поскольку пробы гидрофильных белков готовили для обеих методик схожим образом, следует ожидать и схожих результатов их анализа. Протеомные профили клеток, исследованные двумя типами фореза, частично совпадали (5 общих групп из 14), а в МВ не различались по массам и процентному содержанию 10 из 12 белковых групп (p<0,05).
Различий между активированными и неактивированными клетками и МВ в распределении гидрофильных и гидрофобных белков по массам и долям не было выявлено обеими методиками.
Обе технологии электрофоретического разделения показывают схожие результаты при анализе протеома клеток и МВ клеточной линии NK-92, но есть ряд существенных различий, связанных с чувствительностью методов и особенностями пробоподготовки. При этом каждая из методик имеет как свои достоинства, так и недостатки при использовании. Так, капиллярный электрофорез более удобен и определяет большее количество дискретных групп белков, чем разделение в геле. Однако эта технология не позволяет исследовать мембранные белки и не предназначена для дальнейшего анализа образцов, например на масс-спектрометре. В целом обе методики подходят для анализа белкового профиля клеток и МВ.
Поддержано грантами РФФИ (проекты 17-04-00679 и 19-015-00218).
