По данным некоторых авторов [1], рак шейки матки, инициированный папилломавирусной инфекцией, формируется с непосредственным участием воспалительных цитокинов, большое значение в этом процессе имеет фактор некроза опухоли-α (TNF-α). TNF-α – это провоспалительный медиатор (цитокин), играющий ключевую роль в апоптозе, дифференцировке и пролиферации клеток, а также в формировании противовирусного иммунного ответа организма. Ген TNF-α расположен на 6 хромосоме в локусе 6p21.1-6p21.3 [2].
К настоящему времени в гене TNF-α описано 4 ключевых однонуклеотидных полиморфизма (376 G/A, -308 G/A, -238 G/A и +488 G/A), оказывающих непосредственное влияние на транскрипцию и трансляцию белкового продукта данного цитокина. Наиболее важным из них является транзиция гуанина на аденин в положении -308 промоторной области гена (-308G>A, rs1800629) [3]. При этом было обнаружено, что редкий -308A аллель ассоциирован с более высоким уровнем гена TNF-α, в то время как аллель -308G связан с уменьшением продукции данного цитокина [4].
В последние годы ассоциация полиморфизма rs1800629 с формированием интраэпителиальной неоплазии шейки матки (CIN) изучались различными исследовательскими группами. При проведении мета-анализа этих результатов [5] обнаружены межэтнические различия: в некоторых популяциях, особенно у европейцев, имеется связь по данному маркеру с развитием заболевания, в других исследованиях такая ассоциация не выявлена. В отечественной и зарубежной литературе не нашел отражение вопрос о встречаемости патологии шейки матки у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия, отсутствует стандарт и алгоритм веления этой категории женщин. Вовлеченность генетических полиморфизмов цитокинов в этиопатогенез CIN у женщин узбекской национальности изучена крайне слабо.
Цель работы: оценка патогенетической значимости аллельных и генотипических вариантов полиморфизма rs1800629 TNF-a в формировании CIN матки у женщин узбекской национальности.
Материал и методы исследования
В исследование включена 91 женщина узбекской национальности в возрасте от 24 до 50 лет (основная группа), наблюдавшаяся на базе 2-й клиники Ташкентской медицинской академии. Критериями для включения в исследование служили результаты общеклинического и гинекологического обследования с проведением цитологического исследования. Материалом для цитологического исследования служил соскоб с шейки матки, взятый с помощью цитобранши. Для более точной оценки значимости полиморфного маркера rs1800629 в формировании СIN основную группу разделили на 2 подгруппы. В 1-ю вошли 46 женщин с гиперплазией эндометрия, не имевших CIN. Во 2-ю подгруппу было включено 45 больных с СIN легкой степени. Геномная ДНК выделена из периферической крови с использованием набора «ДНК- экспресс кровь» НПФ «Литех» (Москва). Количественный и качественный анализ образцов ДНК проведен на спектрофотометре NanoDrop 2000 «Thermo Scientific» (USA). SNP – генотипирование образцов ДНК проводили путем полимеразной цепной реакции на термоциклере «Applied Biosystems» 2720 (США), с использованием набора НПФ «Литех» (Москва), согласно инструкции производителя. Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем в ультрафиолетовом свете. При исследовании на вирус папилломы человека наиболее часто встречался 16/18 тип у 28 пациенток из 45 обследованных пациентов 2-й подгруппы, тогда как 31/33 тип встречался в 4 раза реже. В соответствии с современными этическими стандартами у каждой пациентки было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Контролем служили образцы ДНК 95 условно здоровых женщин узбекской национальности без признаков СIN и других гинекологических заболеваний, полученные в банке ДНК отдела молекулярной медицины и клеточных технологий НИИ гематологии и переливания крови МЗ РУз. Лица контрольной группы не имели родственных связей с женщинами основной группы и были сопоставимы с ними по возрасту.
Частоту вариантов аллелей и генотипов (f) вычисляли по формулам: f=n/2Nи f=n/N. Прогностическую эффективность (AUC-классификатор) изученных нами генетических маркеров определяли по стандартной формуле: AUC=(Se + Sp) /2. Соответствие частот генотипов равновесию Харди – Вайнберга оценивали по критерию χ2. Различие частот аллелей и генотипов устанавливали с использованием критерия χ2 и точного критерия Фишера. Оценку отношения шансов и 95% доверительный интервал проводили с помощью пакета программы OpenEpi (ver. 9.3).
Результаты исследования
Результаты анализа распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs1800629 гена TNF-α среди пациенток основной и контрольной групп представлены в таблице.
Частота генотипов G/G, G/A и A/A в основной группе составила соответственно 68,1, 31,9 и 0,0%, в контрольной – 85,3, 13,7 и 1% . Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов риск развития CIN при носительстве мутантного G/A генотипа возрастает почти в 3 раза, и такое различие оказалось статистически значимым (χ2=8,8; Р=0,003; OR=2,95; 95%CI 1,418, 6,138). Эти данные свидетельствуют об ассоциации данного полиморфизма с развитием CIN. Следует отметить, что гомозиготный по редкому аллелю генотип А/А не выявлен ни в одной из групп больных. Необходимо подчеркнуть, что достоверно высокая частота гомозиготного генотипа G/G в контрольной группе и более редкая его встречаемость в основной группе свидетельствуют о протективной роли его в отношении развития CIN (χ2=7,7; Р=0,006; OR=0,4; 95%CI 0,1801, 0,76).
У пациенток 1-й подгруппы А генотип G/A встречался гораздо чаще, чем в контрольной группе (39,15% против 13,7%). Риск развития патологии при наличии данного генотипа увеличивается более чем в 4 раза (χ2=11,7; Р=0,0006; OR=4,0; 95%CI 1,764, 9,322). У больных 2-й подгруппы генотип G/A также выявлялся значительно чаще, чем у лиц контрольной группы (24,4% против 13,7%), однако из-за малого количества наблюдений такое различие оказалось статистически недостоверным (χ2=2,3; Р=0,1; OR=2,0; 95%CI 0,8323, 5,004).
Распределение генотипов полиморфизма rs1800629 среди обследованных женщин 1-й и 2-й подгрупп выглядело таким образом: частота генотипа А/А равна нулю. Результаты по гетерозиготным генотипам G/A отличались, однако различия были незначительными и недостоверными (χ2=2.3; Р=0,1; OR=2,0; 95%CI 0,8066, 4,895).
Таким образом, выявлена достоверная ассоциация между «неблагоприятным» генотипическим вариантом G/A полиморфизма rs1800629 гена TNF-α и CIN, особенно у пациенток с гиперплазией эндометрия.
Обсуждение
Несмотря на ряд проводимых и достаточно интенсивных работ, связанных с изучением влияния полиморфизма rs1800629 гена TNF- α на прогрессирование CIN, данные о формировании индивидуальной предрасположенности к тем или иным поражениям шейки матки у женщин остаются весьма противоречивыми. Результаты исследования характера распределения аллельных и генотипических вариантов полиморфизма rs1800629 соответствуют закономерности, полученные как в европеоидных, так и в азиатских популяциях. Анализ распределения генотипов полиморфизма rs1800629 среди 95 условно здоровых женщин узбекской национальности и 91 пациентки основной группы выявил преобладание гомозиготного G/G варианта (85,3 и 68,1%, соответственно) над гетерозиготным G/A (13,7 и 31,9%, соответственно) и редким гомозиготным A/A генотипом (1,0 и 0%, соответственно). Гомозиготное состояние – G/G исследуемого полиморфного варианта являлось более благоприятным для их носителей, чем гетерозиготное – G/A. Наблюдаемый нами протективный характер G/G генотипа для развития CIN можно объяснить его ассоциацией с низким уровнем транскрипции гена TNF-α. [6]. По данным авторов, замена G308A гена TNF-a влияет на изменение транскрипции и продукции самого медиатора TNF-a [7].
Неблагоприятные генотипы А/А и G/A наоборот, значительно усиливают экспрессию белкового продукта TNF-α [8]. В наших исследованиях вероятность развития CIN у носителей А/G генотипа, ассоциированного с высокой экспрессией TNF-α, оказалась значимо выше (OR=2,95) чем у носителей G/G генотипа ассоциированного с низкой экспрессией белкового продукта TNF-α. Поскольку наличие аллеля А-308 гена TNF-a так же приводит к повышенной экспрессии данного цитокина и ассоциировано с неблагоприятным исходом, то очевидно, что генотипы с наличием этого аллеля являются одними из факторов риска развития дисплазии.
Заключение
Таким образом, полученные нами результаты позволяют утверждать, что полиморфизм G308A гена провоспалительного цитокина TNF-a вовлечен в патогенез CIN. Наличие в генотипе у женщины G/A генотипа полиморфизма rs1800629 гена TNF-a может рассматриваться как наследственная предрасположенность к развитию CIN. Полученные данные открывают перспективы разработки новых подходов ранней диагностики CIN, прогнозирования развития заболевания, выявления групп риска, нуждающихся в тщательном диспансерном наблюдении и ведении пациенток.
