Исследования в области генетики остеопороза активно проводятся в различных странах уже более 20 лет. Наибольшее внимание привлекают попытки выявить ассоциированность аллелей различных кандидатных генов с ранним развитием остеопороза и связанных с ним переломов у женщин в постменопаузальном периоде, что, естественно, связано с широким распространением этого состояния и с его тяжелыми социальными последствиями. Основное внимание было привлечено к исследованиям ассоциированности постменопаузального остеопороза (ПМОП) с полиморфизмами гена рецептора витамина D и коллагена 1 типа 1 и 2, а также генов остеокальцина, остеонектина, остеопонтина и т.п. [27]. Исследования, продолжающиеся в этой области, до сих пор не дали пригодных для клинической практики результатов как ввиду слабой степени ассоциированности отдельных SNP (single-nucleotide polymorphism) с заболеванием, так и ввиду значительных этнических, географических, диетологических, возрастных и других средовых факторов воздействия.
Проводимые в настоящее время полногеномные исследования на больших выборках показывают новые области генетической предрасположенности к развитию остеопороза, например, на хромосомах 1 и 5, и новые гены, продукты которых ранее не рассматривались в качестве участников патогенеза остеопороза [12]. Эти исследования ввели в круг внимания многих научных центров гены цитокинов, ввиду их очевидного участия в регуляции процессов ремоделирования костной ткани.
Одно из центральных мест в этих исследованиях занял ген интерлейкина-6 (IL-6) и ген его рецептора, ввиду их центральной роли в регуляции процессов воспаления и остеогенеза [15, 30]. Не меньший интерес вызвало исследование ассоциированности ПМОП с генотипами других провоспалительных цитокинов – IL-1 [14] и фактора некроза опухоли-α (TNF-α) [11, 21, 26]. Например, исследования ПМОП у японских женщин выявили ассоциированность его развития среди женщин старше 56 лет, находящихся в менопаузе свыше 10 лет, с аллелями гена TNF-α в точках полиморфизма -857, -863 и -1031, причем частота выявляемости аллелей -863А и -1031С среди женщин с низкой минеральной плотностью костной ткани (МПКТ) была практически в два раза выше, чем у женщин с нормальной
МПКТ в поясничном отделе позвоночника [17]. Проведенный линейный регрессионный анализ показал, что общее число редких аллелей, помимо индекса массы тела и числа лет после менопаузы, может являться независимым предиктором ПМОП.
Однако эти исследования имеют недостатки, связанные с попытками анализа ассоциированности ПМОП с отдельными генотипами или аллелями генов цитокинов, что приводит к получению результатов, достоверных при групповом популяционном анализе, но слабо интерпретируемых в реальной клинической практике при разработке персонализированных критериев прогноза раннего развития ПМОП у конкретной женщины с ее индивидуальным генотипом. Исходя из этого нами проведено исследование частоты встречаемости сочетания генотипов ряда цитокинов, выявляемых у каждой женщины, как единого комплексного генетического признака в группах женщин с развивавшимся ПМОП в сопоставлении с аналогичной по возрасту и длительностью менопаузы группой женщин с нормальными показателями МПКТ.
Цель исследования. Оценить роль генетических факторов при остеопорозе и связанных с ним переломов у женщин в постменопаузальном периоде.
Материал и методы исследования
Всего были обследованы 413 человек. Из них 375 человек составили контрольную группу здоровых
женщин без признаков остеопороза пожилого возраста (средний возраст 62,1±6,56 года). С целью
оценки роли генетических факторов при остеопорозе обследованы 38 женщин в возрасте старше
58,8±6,6 года с длительностью менопаузы более 5 лет. Все женщины дали согласие на участие в
исследовании. Протокол исследования одобрен этическим комитетом НИИКЭЛ СО РАМН.
Остеопороз был верифицирован по Т-критерию на уровнях поясничного отдела позвоночника
и проксимального отдела бедренной кости, по данным DXA – ниже -2,5 SD (ВОЗ, 1994, ISCD, 2007). Патологических переломов в анамнезе у пациенток не было. У всех обследованных были исключены другие заболевания или регулярный прием лекарственных средств, ведущих к снижению костной массы. Все женщины относились к одной социально-экономической группе (по характеру питания, экономическим показателям, жилищно-бытовым условиям и т.д.), а также не имели профессиональных вредностей. Больным каждой группы проведены денситометрические исследования. МПКТ поясничного
отдела позвоночника (в передне-задней проекции) и проксимального отдела одной из бедренных костей определялась с помощью двуэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Измерение проводилось на аппарате «Lunar Prodigy» корпорации «GE» (США). Для оценки использовался автоматически вычисляемый Т-критерий, т.е. количество стандартных отклонений в разнице между средним показателем исследуемого участка у лиц соответствующих пола и расы в возрасте 20–45 лет и полученным у данного пациента результатом.
Геномную ДНК выделяли из ядросодержащих клеток 100 мкл периферической крови при помощи
набора реагентов производства ООО «Лаборатория Медиген» (Новосибирск). Исследовали 7 полиморфизмов, локализованных в промоторных регионах генов IL: TNF-α в позициях С-863А, G-308A,
G-238A, IL-1β T-31C, IL-6 G-174C, IL-10 C-592A, сосудисто-эндотелиальныйфакторроста(VEGFA) С-2578А. Анализ исследуемых полиморфизмов проводился с использованием метода рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) с использованием праймеров, описанных ранее [13]. Продукты амплификации подвергались рестрикции соответствующими эндонуклеазами: в случае генотипирования полиморфизма TNF-α С-863А – Bst BAI, TNF-α G-308A – Bsp19 I, TNF-α G-238A – Msp I, IL-1β T-31C – Alu I, IL-6 G-174C – SfaN I, IL-10 C-592A – RsaI, VEGFA C-2578A – Bgl II («СибЭнзим», Новосибирск). Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2–3% агарозном геле. В качестве маркера длин фрагментов ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («СибЭнзим», Новосибирск).
При статистическом анализе результатов генетических исследований использовали такие показтели, как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR), диагностический коэффициент (DK), чувствительность (Se) и специфичность (Sp) [2, 4, 5, 10]. Частоту
аллелей генов цитокинов вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f=n/2N, где n – количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды), 2N – удвоенная численность обследованных. Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n – количество раз встречаемости генотипа (комбинации), N – численность обследованных.
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга по точному методу Фишера [2].
Статистическую оценку силы ассоциации генов, генотипов и их комбинаций с заболеванием проводили по показателю OR (odds ratio – отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе) с расчетом 95% доверительного интервала (95% Confidence Interval – 95% CI) [8].
Достоверность различий частот распределения изучаемых генетических признаков в группах сравнения определяли по критерию χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему
варианту точного метода Фишера (ТМФ) для четырехпольных таблиц [3].
Если хотя бы одна из частот в таблице сопряженности равнялась 0, то расчет OR, DK и ряда
других показателей проводился по модифицированным формулам – ко всем значениям ячеек таблицы 2×2 прибавлялась константа δ=0,5 или 1. В последнем случае, все значения ячеек таблицы сопряженности предварительно удваивались. Данная модификация позволяет избежать ошибочных математических ситуаций, связанных с делением на ноль, или выражений типа lg(0) [1, 7]. Расчет показателей осуществляли с использованием пакета статистических программ Statistica 6.1.
Результаты исследования и обсуждение
Несмотря на относительно небольшое число обследованных нами женщин с ПМОП и значительную контрольную группу, сплошной компьютерный анализ полученных характеристик распределения
как отдельных генотипов цитокинов в 7 полиморфных точках промоторных участках генов IL-1β,
IL-6, IL-10, TNF-α и VEGF, так и всех возможных их сочетаний, выявил 88 достоверно различающихся
параметров с уровнем значимости различий двустороннего критерия ТМФ р<0,05 и находящихся в
диапазоне 95% CI. Сознательное завышение нами требований к повышению уровня достоверности
различий до ТМФ р<0,02, позволило рассматривать 55 комплексных генотипов, частота которых высоко
достоверно различается в группе пожилых женщин с ПМОП и в группе женщин в длительной менопаузе с нормальными показателями МПКТ в поясничном отделе (табл. 1).
Таблица 1. Параметры ассоциированности генотипов цитокинов с ПМОП у женщин.
Таблица 1(1). Параметры ассоциированности генотипов цитокинов с ПМОП у женщин.
Среди отдельных аллелей всех 7 исследованных генов цитокинов достоверные различия выявлены
лишь для полиморфизма гена IL-6 в полиморфной позиции G-174C, что полностью совпадает с результатами, полученными при исследовании европеоидного населения США, показавшими прямую связь этого SNP с МПКТ [29]. Результаты проведенного анализа также подтвердили данные исследования японских женщин в менопаузе, показавшие высокую прогностическую значимость выявления SNP гена TNF-α в полиморфной позиции С-863А для пациенток с низкой МПКТ в отличие от других точек полиморфизма в промоторной области этого гена [17]. Из 55 выявленных нами комбинированных генетических признаков, ассоциированных с развитием ПМОП у женщин в менопаузе, генотипы TNF-α С-863А выявлены в 37 случаях, что составляет почти 70% всех комбинаций генотипов. Преобладающими среди этих генотипов, входящих в достоверно ассоциированные с ПМОП комбинации, оказались генотипы, содержащие аллели С, наиболее широко распространенные среди европеоидного населения России [6] и ассоциированные, по некоторым данным, с низким уровнем продукции самого TNF индивидами с таким генотипом [19].
Как показывает дальнейший анализ, представленных в табл. 1 результатов исследования, наибольшее
число достоверно ассоциированных с развитием ПМОП комбинированных генетических признаков
включает в себя комбинации, состоящие из 4, 5 и 6 различных генотипов, тогда как отдельные аллели
или генотипы встречаются крайне редко. Это, вероятно, объясняет неудовлетворенность исследователей ранее полученными и широко цитируемыми в данной статье результатами исследования ассоциированности различных вариантов остеопороза, впрочем, как и других заболеваний, с отдельными SNP самых различных генов. Величины OR, полученные в таких исследованиях, даже при значительном увеличении числа обследованных лиц, редко достигают значения, приближающиеся или превышающие величину 2,0. Это, в целом, свидетельствует о накоплении у пациентов данного генотипа практически в 2 раза выше, чем в контрольной группе. Однако является ли носительство данного генотипа для конкретного пациента существенным фактором риска развития патологического процесса, остается вопросом.
В представленных нами результатах, несомненно, обращает на себя внимание достижение необычно
высоких для медицинской генетики показателей величины OR, достигающих двузначных величин.
Как правило, это связано с тем, что среди пациентов с ПМОП выявляются такие комбинации генотипов,
которые ни разу не встречаются в значительной (более 350 человек) выборке здоровых женщин,
или их число составляет доли одного процента. Это свидетельствует о том, что для повышения информативности комплексных генетических критериев, пригодных для индивидуального прогнозирования развития и особенностей клинического течения заболеваний, следует учитывать не только этническую компоненту и половую принадлежность, но и возрастные особенности обследованных.
Значительный интерес, на наш взгляд, представляют те данные табл. 1, в которых отражены результаты с наиболее высоким уровнем значимости двустороннего критерия ТМФ≤0,01, с достаточно
широким (5–8% для каждой комбинации генотипов) представительстве таких «прогностически
неблагоприятных» комбинаций генотипов цитокинов среди женщин, течение менопаузы у которых
сопровождается развитием ПМОП. Можно лишь предположить, что достаточно широко распространенное и во многом естественное для пожилых лиц развитие остеопороза является в какой-то мере фактором, связанным с увеличением продолжительности, но не качества жизни. Несомненно, этот вопрос требует дальнейших многоцентровых исследований на значительных представительных группах и длительных проспективных наблюдений, что проводится сейчас в рамках Российской ассоциации по остеопорозу.
Значительную долю (почти 80%) среди входящих в эти высоко достоверно ассоциированные с
ПМОП комбинации генотипов цитокинов занимают генотипы IL-6. Все эти генотипы включают
в себя аллель С в гомозиготном (в 14 из 17) или редко в гетерозиготном генотипе. Согласно результатам известной базы данных «Cytokine gene poly-morphism in human disease» [19], эти аллели ассоциированы с высоким уровнем экспрессии провоспалительного цитокина IL-6. Ввиду того, что IL-6
стимулирует костную резорбцию остеокластами в условиях дефицита эстрогенов [25], преобладание
среди генотипов пациенток с ПМОП С аллелей его гена в позиции полиморфизма промотора G-174/C
может иметь отношение к ускоренному развитию у них остеопоретических процессов.
Столь же часто среди высоко достоверно ассоциированных с развитием ПМОП генотипов выявляются аллели G гена TNF-α в позиции A-308G. Как известно, эти аллели в полиморфной позиции промотора связаны с пониженной транскрипционной активностью продуцирующих TNF-α моноцитами и Т-лимфоцитами и его низкой продукцией [28]. С этим аллелем G и генотипом GG оказалась связана
меньшая ширина зоны надкостницы и эндокортикального слоя, меньшая прочность кости на изгиб
и повышение риска перелома шейки бедра [20]. Учитывая существование данных о том, что связанное с возрастом повышение уровня TNF-α приводит к утрате регенераторного потенциала костной ткани и повышению риска развития переломов, наличие в генотипе пациенток в менопаузе GG генотипов может служить одним из факторов развития остеопороза на фоне пролонгированной активации остеокластогенеза [24].
Кроме того, обращает на себя внимание очевидное преобладание среди всех вошедших в число высоко достоверно ассоциированных с ПМОП комбинированных генетических признаков генотипов фактора роста сосудистого эндотелия VEGF. Его присутствие в этих комбинациях достигает почти 80%. Во всех случаях эти генотипы в точке полиморфизма A-2578C (rs 699947) содержат аллель С в гомозиготном или гетерозиготном варианте. Наличие именно этого аллеля С в данной полиморфной позиции промоторного участка всех высоко гомологичных генов семейства VEGF приводит к высокому уровню экспрессии гена и высокому уровню продукции самого VEGF стимулированными лимфоидными
клетками [22].
Один из этих белков является плацентарным ростовым фактором (PIGF), экспрессируемым тромбобластами и стимулирующим развитие сосудистой сети в плаценте [23]. Учитывая важнейшую роль белков семейства VEGF в стимуляции ангиогенеза, лимфангиогенеза, ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса, клеточной адгезии и клеточной миграции, в ингибировании апоптоза, очевидно, что люди, в геноме которых присутствуют аллели, ассоциированные с более высоким уровнем его продукции, имеют определенное преимущество в продлении срока жизни.
В пользу такой гипотезы свидетельствуют и наши данные о повышении частоты альтернативных генотипов АА гена VEGF, ассоциированных с низким уровнем его продукции, среди женщин с раком
молочной железы [9], и данные о повышении этого генотипа у пациентов с коронарным атеросклерозом [18], а также у пациентов с болезнью Альцгеймера [16].
Полученные данные подтверждаются и результатами, представленными в табл. 2. Для анализа
совокупного вклада в развитие заболевания многоаллельных систем, независимо действующих и/или взаимодействующих полиморфных генов, нами разработан программный алгоритм, основанный на
методе прямого сравнительного анализа распределения различных вариантов «генетических ансамблей», включающих от 2 до 7 аллелей отдельных генов, полиморфизм каждого из которых исследован у одних и тех же индивидов. При этом входящие в ансамбль аллели порознь могут быть не ассоциированы или ассоциированы более слабо с восприимчивостью к заболеванию.
Таблица 2. Полилокусные комбинации аллелей у пациенток с ПМОП.
Как видно из табл. 2, исследование полилокусных комбинаций отдельных аллелей генов цитокинов
показывает, что наличие их некоторых комбинаций у женщин в менопаузе с ПМОП также обладает
высокой прогностической значимостью, что подтверждается как высокими показателями специфичности выявляемых комбинированных признаков, так и практически отсутствием их в значительной по объему выборке группы женщин в менопаузе без признаков ПМОП.
Таким образом, полученные в результате проведенного исследования данные демонстрируют, что
с использованием комбинированных генетических признаков, состоящих из сочетаний 3, 4, 5, 6, 7 генотипов цитокинов и ростовых факторов, с помощью определенного программного обеспечения, позволяющего в автоматическом режиме проанализировать частоты всех практически встречающихся
комбинаций отдельных генотипов в рамках одного генома каждого пациента, удается выделить высоко достоверные прогностические признаки предрасположенности женщины к развитию остеопороза в менопаузе.
Эти признаки обладают высокими величинами OR и 100% специфичностью, т.к. к возрасту обследования практически не выявляются в контрольной группе женщин, находящихся в менопаузе и обладающих нормальными значениями МПКТ. Это позволяет рассматривать их в качестве перспективных признаков для дальнейшей разработки персонализированных критериев раннего прогноза предрасположенности женщин к развитию ПМОП в рамках многоцентровых исследований. Разработка таких критериев позволит осуществлять персонализированные программы профилактики раннего развития ПМОП и связанных с ними переломов костей у женщин в менопаузе.
Проведение персонализированных программ профилактики развития переломов у пожилых женщин
сулит значительные фармакоэкономические и социальные эффекты ввиду потенциального снижения
значительных затрат на лечение и реабилитацию этой торпидной к проводимой терапии патологии.
Выводы
1. Среди женщин в постменопаузальном периоде выявлен целый ряд комбинированных генетических
факторов риска развития остеопороза, представляющих собой сложные генотипы полиморфных
участков промоторных зон генов цитокинов с прои антивоспалительной активностью, а также гена
фактора роста сосудистого эндотелия.
2. Специфичность таких генетических факторов риска развития остеопороза достигает в ряде случаев
100% в связи с тем, что такие комбинации генотипов полностью отсутствуют в контрольной группе женщин в постменопаузальном периоде с отсутствием клинических и инструментальных признаков наличия остеопороза.
3. Высокая степень ассоциированности развития остеопороза у части женщин в постменопаузальном
периоде с аллельными вариантами полиморфных участков промоторных зон генов цитокинов, вероятно, свидетельствует об участии цитокинов с провоспалительной, антивоспалительной активностью и фактора роста сосудистого эндотелия в нарушениях процессов ремоделирования костной ткани у пожилых женщин.
