Введение. Тромбоциты играют ключевую роль в клеточном гемостазе и тесно связаны с плазменным гемостазом. Исследование функции тромбоцитов у новорожденных детей, особенно недоношенных, осложняется большим объемом образца крови, отсутствием стандартизации и референтных интервалов для выполнения большинства функциональных тестов, а также неполным пониманием функционального фенотипа неонатальных тромбоцитов [1]. «Золотым стандартом» исследования функции тромбоцитов до сих пор является турбидиметрический метод агрегации тромбоцитов с различными агонистами, требующий 400 мкл богатой тромбоцитами плазмы [2].
Современный тест функциональной активности тромбоцитов (ФАТ), осуществляемый методом проточной цитофлуориметрии (ПЦ), дает полную информацию о функциональном состоянии тромбоцитов и их способности к активации в присутствии агонистов [3]. Использование 20 мкл цельной крови без предварительной обработки дает возможность широкого применения ФАТ для новорожденных [4].
Цель: адаптировать метод ПЦ для оценки тромбоцитарного гемостаза и определить референтные значения ФАТ у здоровых новорожденных.
Методы. Исследовали периферическую кровь с цитратом натрия 3,2%, полученную у 10 здоровых новорожденных 1–3 сут жизни. Поверхностные рецепторы и внутриклеточные гранулы определяли с помощью моноклональных антител к CD61 (PE), CD42b (PE), PAC1 (FITC), CD62P (Alexa647) и аннексину V (Alexa 647). Общее количество антигена оценивали по интенсивности флуоресценции нативных и активированных смесью АДФ, активаторов тромбинового рецептора SFLLRN (активатор PAR1) и AYPGKF (активатор PAR4) тромбоцитов. Пробы анализировали на цитометре Gallios (Beckman Coulter, США). При расчете нормативных значений использовали формулы для нижней границы: М–2SD/М×100% (1) и Ма–2SD/Ма×100% (2), а для верхней границы: М+2SD/М×100% (1) и Ма+2SD/Ма×100% (2) в случае нативных (1) и активированных (2) тромбоцитов соответственно. Оценка «прокоагулянтных» тромбоцитов осуществлялась от общего числа тромбоцитов, несущих на своей поверхности фосфатидилсерин (аннексин V, ФС). Для анализа плотных гранул тромбоциты предварительно нагружали мепакрином (Me): индекс активации: Ме/Ме акт; объем секреции Ме-Ме акт.
Результаты. В состоянии покоя общее количество интегрина ß3 (CD61) на поверхности тромбоцитов составляет 28–171%, гликопротеина GP-1b (CD42b) – 30–170%, активированного гликопротеина IIbIIIa (PAC1) – <5%, P-селектина (CD62p) – 1,3–20%, количество тромбоцитов с ФС – 0%; после воздействия смеси активаторов экспрессия CD61 составила 50–463%, CD42b – 3–117%, PAC1 – 15–185%, CD62p – 70–129%, количество тромбоцитов с ФС – 0,93–3,57%. Индекс активации плотных гранул 1,4–2,9. Объем секреции плотных гранул 36–164.
Выводы. Методом ПЦ получены референтные интервалы функциональной активности тромбоцитов у здоровых новорожденных.
