Результативность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в последние годы неуклонно растет, однако 60% женщин по-прежнему не способны к достижению клинической беременности в одном лечебном цикле, а 20% – после трех циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1]. Известно, что даже перенос морфологически качественного эмбриона в эндометрий, структурно соответствующий фазе менструального цикла, не всегда приводит к достижению беременности, а наступившая беременность в ряде случаев прекращает развитие на ранних сроках [2]. Процесс имплантации зависит от синхронизации различных факторов, таких как качество эмбриона, оптимальные условия культивирования, рецептивность эндометрия и материнская иммунная система [3]. При этом приблизительно за две трети неудач имплантации ответственна неадекватная восприимчивость эндометрия, тогда как состояние эмбриона – только за одну треть [4]. Значительный процент прекращения развития эмбрионов связан с наличием у них хромосомных аномалий.
Исследователи уделяют большое внимание изучению роли различных факторов в генезе повторных имплантационных потерь. В связи с этим целью данной статьи является обзор имеющихся в литературе данных о причинах повторных неудач имплантации в программе ЭКО, а также дефиниции терминологии.
Определение
Повторные неудачи имплантации (recurrent implantation failure (RIF)) в программе ЭКО – клиническая ситуация, когда неоднократно не удается достичь стадии визуализации плодного яйца в полости матки при ультразвуковом исследовании (УЗИ) после переноса эмбриона. По мнению Coughlan и соавт. (2014), возможны два варианта данной ситуации, в первом из них отсутствуют доказательства имплантации (отрицательные уровни β-субъединицы хорионического гонадотропина), а во втором имеются доказательства имплантации (положительные уровни β-субъединицы хорионического гонадотропина), но по данным УЗИ плодное яйцо отсутствует [5].
Несмотря на большое количество исследований, посвященных данной проблеме, не существует общепринятого определения RIF в программе ЭКО [3, 5, 6]. Некоторые авторы при установлении RIF основываются только на количестве перенесенных эмбрионов, другие на количестве неудачных циклов. Так, F. Aletebi и соавт. (2010) полагают, что RIF – это отсутствие клинической беременности после переноса 3 или более эмбрионов [7]. С.С. Huang и соавт. (2011) верифицируют RIF после двух неудачных циклов, Sacks и соавт. (2012) – трех попыток ЭКО [8, 9]. Другие исследователи учитывают оба фактора и считают, что о RIF свидетельствует отсутствие беременности после переноса от 2 до 10 и более эмбрионов в минимум двух или трех циклах ВРТ [5, 10, 11]. Рolansky (2014) полагает, что для определения RIF общее число перенесенных эмбрионов должно быть не менее 4 на стадии дробления или 2 бластоцист [10]. Большинство авторов учитывают эмбрионы только хорошего качества, имеющие количество клеток, соответствующее дню развития, а в случае переноса бластоцисты – качество внутренней клеточной массы и трофоэктодермы [5, 7, 8, 10, 12]. Другие критерии включают наличие бластомеров одинакового размера, равномерность их распределения, а также наличие менее 10% фрагментации [13].
Последнее определение RIF, предлагаемое в недавнем обзоре литературы С. Сoughlan и соавт. (2014), включает не только количество эмбрионов и проведенных циклов ЭКО/ИКСИ, но также возраст женщины до 40 лет [5].
С. Tan и соавт. (2005) исключают из определения RIF криопротоколы, основываясь на том, что частота имплантации размороженных после криоконсервации эмбрионов ниже, чем в свежих циклах [14]. Однако систематический обзор и мета – анализ 3 рандомизированных клинических исследований (2013) показал более высокую частоту клинической и прогрессирующей беременности в криопротоколах [15]. По данным B.S. Shapiro и соавт (2014) частота родов живым плодом в криоциклах существенно выше в сравнении со свежими циклами (OR 3,8, 95% CI 2,1–7,2; р<0,0001) [16]. Следовательно, при определении RIF необходимо учитывать как свежие циклы ЭКО, так и криопротоколы.
Следует отметить, что термин «повторные неудачи имплантации» не является эквивалентом повторных неудач ЭКО, к которым следует относить невозможность достижения беременности после нескольких попыток у пациенток старшего репродуктивного возраста, при «бедном» овариальном ответе и субоптимальном качестве эмбрионов [5].
Таким образом, основываясь на приведенных данных литературы, RIF – отсутствие клинической беременности у пациенток в возрасте до 40 лет после двух последовательных попыток ЭКО/ИКСИ или криоциклов в которых общее число перенесенных эмбрионов не менее чем 4 на стадии дробления или 2 бластоцисты хорошего качества.
Причины повторных неудач имплантации
Повторные неудачи в программе ЭКО могут быть обусловлены дефектами гамет, эмбрионов, а также патологией матки и эндометрия. В отечественной и зарубежной литературе обсуждается роль врожденных тромбофилий, антифосфолипидного синдрома, эндометриоза, синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), иммунологических факторов, воспалительных заболеваний маточных труб и миомы матки в генезе повторных неэффективных программ ЭКО. Отдельного внимания заслуживают идиопатические RIF – неспособность к достижению беременности после переноса эмбрионов хорошего качества при исключении патологических изменений матки и эндометрия, а также любых других нарушений у женщины и отсутствие патозооспермии у мужчины [12]. По данным X. Yang с соавт. (2016) частота встречаемости идиопатических RIF составляет 8% [17].
Качество ооцитов
Важным фактором, определяющим исход цикла ЭКО, является качество полученных эмбрионов, которое во многом зависит от морфологической и структурной зрелости гамет [18]. В исследованиях на животных было показано, что качество ооцитов играет более важную роль, чем качество сперматозоидов, что можно объяснить различиями между гаметогенезом у мужчин и женщин [19]. Качество яйцеклеток отражают морфологические, генетические, метаболические и эпигенетические характеристики. Однако в рутинной клинической практике лабораторий ЭКО применяется оценка клеток преимущественно по их морфологическим параметрам. В литературе обсуждается связь между качеством полученных при стимуляции функции яичников ооцитов и неудачами имплантации в программе ЭКО [11, 20].
Аномалии строения ооцитов (дисморфизмы) могут быть обусловлены возрастом женщины, генетическими дефектами, наличием метаболических нарушений, гинекологическими заболеваниями (наружный генитальный эндометриоз, СПКЯ), а также влиянием стимуляции суперовуляции и ответом яичников [20, 21]. B. Balaban и соавт. (2006) было показано, что 60–70% аспирированных ооцитов имеют различные аномальные морфологические характеристики [22]. Ряд авторов объясняют это тем, что стимуляция функции яичников приводит к созреванию когорты фолликулов, которые в естественном цикле должны были подвергнуться атрезии [21, 22]. Существуют доказательства того, что чрезмерный ответ яичников на стимуляцию суперовуляции, высокая суммарная доза гонадотропинов приводит к появлению дисморфизмов ооцитов и высокой частоте неудачи оплодотворения [5, 18, 20, 21]. Среди различных видов аномалий строения ооцитов наиболее значимой в этиологии RIF является уплотнение зоны пеллюцида, и как результат – ее неспособность к разрыву и нарушение естественного хэтчинга [3].
R. Figueira и соавт. (2010) полагают, что возраст женщины не влияет на морфологические параметры ооцитов. Авторы объясняют это тем, что качество ооцитов у пациенток старшего возраста не может оцениваться по морфологическим критериям, поскольку связано с повышенной вероятностью хромосомных аномалий [5, 21]. Частота встречаемости анеуплоидии в ооцитах, полученных в естественных циклах, составляет около 20%, в стимулированных – варьирует от 20 до 70% и напрямую зависит от возраста женщины [23]. При этом у пациенток с RIF анеуплоидии ооцитов наблюдаются в 65,5% случаев [24]. Возрастное снижение качества ооцитов связано не только с повышенной вероятностью хромосомных аномалий, но и со снижением потенциала митохондриальной мембраны и увеличением повреждений митохондриальной ДНК яйцеклеток [25].
В настоящее время признано, что в процессе имплантации важную роль играют кумулюсные клетки, которые связаны с ооцитом от стадии антрального фолликула до этапа оплодотворения и раннего развития эмбриона [5, 26]. Кумулюсные клетки являются источником простагландинов и ангиогенных факторов (сосудистый эндотелиальный фактор роста), которые имеют значение в ангиогенезе при имплантации. Исследования Аssou и соавт. (2010) показали, что экспрессия генов клетками кумулюсного окружения ооцита коррелирует с качеством ооцитов и эмбрионов [26]. M. Benkhalifa с соавт. (2012) в проспективном рандомизированном исследовании отметили улучшение исходов программы ЭКО при совместном культивировании эмбрионов с кумулюсными клетками у пациенток с RIF [5, 27].
В ряде работ была показана взаимосвязь гинекологических заболеваний с качеством ооцитов, полученных в программе ЭКО. Так, экспериментальные исследования на модели мыши доказали, что развитие перитонеального эндометриоза ассоциировано со снижением качества ооцитов и количеством эмбрионов [28]. I. Díaz и соавт. (2000) при анализе циклов донации ооцитов выявили значительно более низкую частоту имплантации у реципиентов, которые получали ооциты от доноров с эндометриозом, в то время как использование ооцитов от здоровых доноров не снижало частоту наступления беременности у реципиентов с эндометриозом [29]. Таким образом, эндометриоз, вероятно, в большей степени затрагивает качество яйцеклеток, а не рецептивность эндометрия.
Однако существует мнение, что эндометриоидные кисты яичников не оказывают неблагоприятного воздействия на качество ооцитов, эмбрионов и исход программ ВРТ. В недавнем мета – анализе и систематическом обзоре (2015) было показано, что при эндометриоидных кистах яичников наблюдается существенно меньшее количество полученных ооцитов, зрелых ооцитов и эмбрионов, а число эмбрионов хорошего качества, частота имплантации, клинической беременности и родов живым плодом сопоставимы с группой здоровых женщин. Более того, анализ фолликуло- и оогенеза в яичнике с эндометриоидной кистой в сравнении с интактным не показал статистически значимых различий в количестве полученных ооцитов, эмбрионов хорошего качества, частоте оплодотворения и дробления [30].
Качество сперматозоидов
В литературе имеются данные, что RIF могут быть обусловлены увеличением в эякуляте доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Однако единого мнения о влиянии нарушения структурной организации хроматина сперматозоидов на исход цикла ЭКО/ИКСИ не существует, а взаимосвязь с RIF до конца не установлена. Так, E. Seli и соавт. (2004) считают, что нарушение целостности ДНК сперматозоидов не влияет на исход цикла ЭКО, а играет важную роль в генезе невынашивания беременности [31]. Другие полагают, что повреждение ДНК в сперматозоидах часто не оказывает негативного воздействия на оплодотворение ооцита и начальные стадии дробления эмбрионов, но имеет важное значение для формирования бластоцисты и имплантации эмбриона, снижая тем самым частоту наступления беременности в программе ЭКО [32]. При этом следует обратить внимание, что при высоком уровне фрагментации ДНК спермы, вероятность развития нормального и жизнеспособного эмбриона частично зависит от способности ооцита восстанавливать повреждение хроматина сперматозоидов [33].
Большинство опубликованных статей отмечают увеличение числа анеуплоидий сперматозоидов в группах с патозооспермией в супружеских парах с неудачными попытками ЭКО/ИКСИ [34, 35]. L. Rodrigo и соавт. (2010) оценивали влияние различных видов анеуплоидий в сперматозоидах на хромосомный набор предимплантационных эмбрионов. Авторы делают вывод, что супружеские пары с мужским фактором бесплодия и увеличением доли сперматозоидов с диплоидией составляют группу риска по неудачам имплантации при проведении программы ЭКО, а также по спонтанному прерыванию беременности на ранних сроках [34]. Другие исследователи наблюдали увеличение случаев дисомий по половым хромосомам в сперме в парах с RIF после ИКСИ [3, 35].
Курение, половые инфекции, ожирение, а также химио- и радиотерапия способствуют повреждению ДНК сперматозоидов [5].
Маточный фактор и роль эндометрия в повторных неудачах имплантации
Имплантационный потенциал эндометрия и синхронизация с развитием эмбриона является ключевым моментом эффективности программ ВРТ. Известно, что имплантация эмбриона возможна только в течение ограниченного периода времени максимальной рецептивности эндометрия. Это так называемое «окно имплантации», период которого составляет несколько дней – примерно с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла, на 6–10-й день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) [2, 36]. В этот момент происходят генотипические и фенотипические изменения клеток эндометрия. Результатом является двусторонний «диалог» эндометрия с эмбрионом, который возможно приведет к успешной аппозиции, адгезии, инвазии и имплантации эмбриона [12]. При воздействии повреждающих факторов потеря эндометрием рецептивности означает утрату способности к взаимодействию, что влечет за собой срыв имплантации или развитие ее патологических вариантов [37]. В качестве факторов, повреждающих рецептивность и имплантационный потенциал эндометрия, могут выступать гинекологические заболевания, которые нередко выявляются у пациенток с RIF. Так, по данным ряда авторов, у женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе частота встречаемости хронического эндометрита составляет 30–83,3%, полипов эндометрия – 13%, гиперплазии эндометрия – 10% [38].
Роль хронического эндометрита в этиологии повторных неудач имплантации в программе ЭКО остается спорной и до конца неясной, что может быть связано с отсутствием четких диагностических критериев данного заболевания и возможностью установления диагноза только при морфологическом исследовании биоптата эндометрия. Хронический эндометрит, по мнению одних авторов, часто ассоциируется с бесплодием и неудачными попытками ЭКО, а, по мнению других – не влияет на репродуктивную систему и исходы программ ВРТ. Так, по данным J.C. Kasius и соавт. (2011) не выявлена связь между RIF и хроническим эндометритом [39]. J. MacAnanny и соавт. (2010), напротив, при ретроспективном исследовании в 30,3% случаев у пациенток с повторными неудачными попытками ЭКО диагностировали хронический эндометрит [40].
Полипы эндометрия могут вызывать локальные воспалительные изменения, обусловленные увеличением числа тучных клеток и матриксных металлопротеиназ. Кроме этого, наблюдается уменьшение экспрессии мРНК генов HOXA10, HOXA11 и увеличение продукции гликоделина, который ингибирует активность естественных клеток-киллеров. Несмотря на то, что эти изменения приводят к нарушению рецептивности и имплантационного потенциала эндометрия, выявление полипа размерами до 20 мм при проведении овариальной стимуляции не снижает частоту имплантации, клинической беременности и родов живым плодом [41].
Спорным остается и значение аденомиоза в генезе RIF. Одни исследования показывают отсутствие негативного влияния данного заболевания на исход цикла [42], другие подтверждают существенное снижение частоты наступления беременности в программе ЭКО [43].
Ретроспективный анализ результатов иммуногистохимического исследования эндометрия, полученного в позднюю лютеиновую фазу цикла у пациенток с неудачами имплантации и аденомиозом, показал значимое (р=0,004) увеличение макрофагов в железах поверхностного эпителия и естественных клеток киллеров в строме. Авторы полагают, что накопление макрофагов в железах поверхностного эпителия эндометрия может создавать негативную для имплантации эмбрионов среду, поскольку макрофаги, как известно, имеют способность секретировать цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа и интерлейкин-1, а также активные формы кислорода и азота, которые потенциально токсичны для эмбрионов [43]. Полученные данные позволили K. Tremellen и соавт. (2012) сделать вывод об иммунологических механизмах неудач имплантации при аденомиозе [43].
Одним из механизмов нарушения рецептивности у пациенток с эндометриозом является существенное уменьшение экспрессии HOXA10 в клетках стромы эндометрия, и как результат – снижение αvβ3 интегрина. Кроме этого, повышенные уровни фермента ароматазы в эндометрии приводят к изменению экспрессии эстрогеновых рецепторов, что подавляет уровни αvβ3 интегрина и ухудшает имплантацию эмбриона [2]. D. De Ziegler и соавт. (2016) обсуждают роль нарушений экспрессии генов и воспаления в возникновении резистентности к прогестерону, как факторов, снижающих рецептивность эндометрия у пациенток с эндометриозом [44].
Высокие уровни ЛГ в фолликулярную фазу менструального цикла, гиперандрогения, инсулинорезистентность, повышение концентраций эстрогенов в день введения триггера овуляции при СПКЯ были предложены как факторы, оказывающие негативный эффект не только на качество ооцитов, но и рецептивность эндометрия. Повышение концентрации тестостерона в исследованиях in vitro подавляют экспрессию HOXA10 в клетках эндометрия, как напрямую, так и за счет нивелирования стимулирующего эффекта эстрогенов и прогестерона. Помимо этого в эндометрии пациенток с СПКЯ наблюдается избыточная экспрессия андрогеновых рецепторов, снижение уровней αvβ3 интегрина, гликоделина, инсулиноподобного фактора роста-1, нарушение экспрессии генов, что вносит свой вклад в неудачи имплантации в программе ЭКО [2].
Доказано негативное влияние гидросальпинксов на исходы программ ВРТ за счет эмбриотоксического воздействия жидкости, поступающей в полость матки, а также снижения рецептивности эндометрия из – за нарушенной экспрессии цитокинов, участвующих в имплантации. В ряде исследований было показано подавление экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF), αvβ3 интегрина, HOXA10 у пациенток с гидросальпингсами, что отражает снижение имплантационного потенциала эндометрия [5, 42, 45].
Врожденные аномалии развития матки также могут быть причиной неудачи имплантации в циклах ЭКО. Неблагоприятное воздействие данной патологии на рецептивность эндометрия связывают с нарушением экспрессии мРНК генов гомеобокса HOXA10 и HOXA11, поскольку последние играют важную роль в регуляции развития Мюллеровых каналов, дефект формирования которых приводит к большей части аномалий развития матки [5].
Описано несколько механизмов, посредством которых миома матки отрицательно влияет на имплантацию эмбриона, в том числе увеличение сокращений миометрия, измененный профиль цитокинов, аномальная васкуляризация эндометрия, хронические воспалительные процессы, а также изменение экспрессии белка HOXA 10 в стромальных клетках во время окна имплантации у 69% больных [5, 45]. Известно, что субмукозная и интерстициальная миома матки с деформацией полости связаны со снижением частоты имплантации в циклах ЭКО, что подтверждается увеличением частоты наступления беременности после оперативных вмешательств [5]. Спорным остается влияние на исход программ ВРТ интерстициальной миомы без деформации полости матки. Некоторые исследования указывают на негативное влияние интерстициальной миомы матки на имплантацию и частоту наступления беременности в программе ЭКО, в частности, при размерах более 4 см, в то время как другие не находят этой взаимосвязи [5]. При этом удаление интерстициальных узлов без деформации полости матки не увеличивает частоту клинической беременности и родов живым плодом [5, 44], что подтверждает негативное влияние миомы матки на рецептивность эндометрия.
Нарушение регенерации эндометрия после механической травмы или воспалительного процесса является одной из причин возникновения внутриматочных синехий, которые препятствуют успешной имплантации эмбриона к поверхности эндометрия, и встречаются в 8,5% случаев у пациенток с RIF [5, 46, 47]. В поврежденном эндометрии наблюдается гипоксия, уменьшение неоангиогенеза, а также изменение экспрессии цитокинов, ассоциированных с процессами адгезии [47].
Одной из возможных причин неудач ВРТ может быть изменение рецептивности эндометрия в стимулированных циклах. С одной стороны, в ряде исследований показан антипролиферативный эффект аналогов гонадотропин-рилизинг гормона на эндометрий, поскольку использование как агонистов, так и антагонистов приводит к снижению секреции ЛГ в лютеиновой фазе стимулированного цикла, а значит, к нарушению функции желтого тела и низким уровням прогестерона [48]. С другой стороны, проведение овариальной стимуляции приводит к изменению экспрессии маркеров рецептивности эндометрия. Так, в ряде работ выявлено снижение секреции LIF и интегринов в эндометрии стимулированных циклов, раннее появление зрелых пиноподий, а также изменение экспрессии рецепторов эстрадиола и прогестерона [49, 50].
В литературе обсуждается роль преждевременной лютеинизации (повышение уровня прогестерона в сыворотке крови в день введения триггера овуляции), как одной из причин RIF [1, 5]. Так, L. Liu и соавт. (2013) в ретроспективном исследовании 6673 циклов ЭКО/ИКСИ обнаружили, что повышение уровня прогестерона в день введения триггера овуляции более 6 нмоль/л встречалось в два раза чаще у пациенток, имевших в анамнезе 2 и более неудачные программы. В основе негативного влияния преждевременной лютеинизации на исход цикла лежит опережение созревания эндометрия, смещение «окна имплантации» вперед и как результат – асинхронное взаимодействие с эмбрионом. Кроме этого, повышенные уровни прогестерона в день назначения триггера овуляции вызывают значительные нарушения в профиле экспрессии генов эндометрия, ответственных за рецептивность [1].
Заключение
Таким образом, несмотря на достаточное количество публикаций, посвященных проблеме повторных неудач имплантации в программе ЭКО, ряд вопросов остаются нерешенными. Недостаточно изучена молекулярная биология гамет, эмбрионов и эндометрия у пациенток с RIF. Использование «OMICs» технологий (геномика, эпигеномика, протеомика, метаболомика) приведет к пониманию механизмов, вовлеченных в процессы оогенеза, эмбриогенеза и имплантации эмбрионов, что позволит оптимизировать исходы циклов ВРТ. Необходимы дальнейшие исследования экспрессии мРНК генов маркеров рецептивности эндометрия у пациенток с RIF и эндометриозом, миомой матки, патологией эндометрия. Принятие единой терминологии, а также уточнение прогностической роли каждого из факторов (гаметы, эмбрионы, эндометрий) определит тактику преодоления повторных неудач имплантации в циклах ВРТ.
