Введение. Известны лабораторные методы определения цитотоксической активности (ЦА) NK-клеток – с использованием клеток-мишеней К562 и по экспрессии лизосомального маркера CD107a. NK-клетки присутствуют в эндометрии и децидуальной оболочке. Функции NK-клеток матки и особенности взаимодействия NK-клеток и клеток трофобласта остаются малоизученными.
Целью работы явилась разработка и апробация метода оценки ЦА NK-клеток периферической крови в отношении клеток трофобласта в модели in vitro.
Материалы и методы. Обследованы здоровые небеременные женщины без предшествующих беременностей и с предшествующей одной или несколькими физиологически протекавшими беременностями, закончившимися родами в срок (фертильные), женщины с неосложненной (физиологической) беременностью на сроке 6–7 недель. NK-клетки получали из периферической крови, выделяя мононуклеары в градиенте плотности Histopaque®-1077 (Sigma Aldrich). Используя проточный сортировщик клеток FACSAra III (BD), также выделяли NK-клетки из пула мононуклеаров. Предварительно культивированные в присутствии 1% раствора HEPES и 10% ЭТС клетки трофобласта линии Jeg-3 обрабатывали раствором 4мкМ CFSE и помещали в 96-луночный планшет. В часть лунок с клетками трофобласта вносили мононуклеары периферической крови (соотношение эффектор:мишень 10:1) либо NK-клетки, выделенные из мононуклеарной фракции (соотношение эффектор:мишень 5:1). Центрифугировали планшеты 3 минуты, 100g и инкубировали клетки 4 ч. Затем оценивали количество нежизнеспособных клеток трофобласта, обработанных раствором propidium iodide в конечной концентрации 0,01 мг/мл (Sigma Aldrich), на проточном цитофлюориметре FacsCantoII (B).
Результаты. Установлено, что NK-клетки периферической крови повышали гибель клеток трофобласта линии Jeg-3 как в случае добавления в составе мононуклеаров, так и в случае предварительного изолирования NK-клеток из мононуклеарной фракции (p˂0,001). ЦА NK-клеток была выше после предварительной инкубации с IL-2 по сравнению с NK-клетками, не инкубированными с IL-2, во всех обследованных группах (p˂0,001). У женщин с физиологической беременностью ЦА NK-клеток в составе мононуклеаров, предварительно культивированных с IL-2, была ниже, чем в случае NK-клеток, полученных от здоровых небеременных фертильных женщин при аналогичных условиях культивирования (p˂0,001). Для изолированных из состава мононуклеаров NK-клеток женщин с физиологической беременностью не было выявлено различий с ЦА NK-клеток здоровых небеременных женщин. Различия ЦА NK-клеток у небеременных и беременных женщин, вероятно, являются следствием успешной имплантации при физиологической беременности. Различия ЦА NK-клеток в отношении клеток трофобласта в составе мононуклеаров и изолированно указывают на наличие дополнительного модулирования функции NK-клеток другими мононуклеарами.
Заключение. Использование цельной мононуклеарной фракции приближает используемую нами модельную систему к ситуации in vivo. Работа поддержана грантом НШ-2873.2018.7, Гос. заданием АААА-А19-119021290116-1.
