Noninvasive prenatal DNA test as a screening procedure for women from different risk groups: A view on the problem

N.K. Tetruashvili, L.V. Kim, N.G. Parsadanyan, N.I. Fedorova, I.Yu. Barkov, E.S. Shubina, D.Yu. Trofimov

Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow 117997, Ac. Oparina str. 4, Russia
Objective. To evaluate the efficiency of a noninvasive prenatal test (NIPT) to identify chromosomal anomalies in maternal blood samples.
Material and methods. The review included the data of foreign and Russian articles published in the past 15 years and found in Pubmed on this topic.
Results. This review gives the results of recent studies determining the sensitivity, specificity, and accuracy of the noninvasive prenatal DNA test versus conventional screening techniques for pregnant women. It sets forth leading obstetric societies’ viewpoints about the place of this screening technique in prenatal testing.
Conclusion. NIPT is a promising prenatal screening technique for its clinical introduction, by complying with the legal norms.

Keywords

noninvasive prenatal DNA test
aneuploidies
NIPT
free DNA
pregnancy
screening

Хромосомные нарушения, в частности, анеуплоидии по 21-й и 18-й хромосомам являются одной из ведущих причин перинатальной смертности и детской инвалидности в развитых странах (Информационный бюллетень ВОЗ N 370).

Беременности плодом с хромосомной патологией часто сопровождаются угрожающим выкидышем, неоднократными кровотечениями, нередко заканчиваются преждевременными родами. Вместе с тем, в подобных клинических ситуациях проведение инвазивных методов пренатальной диагностики затруднено и без веских оснований противопоказано. Исследования последних лет показали, что причиной около 60,0% спорадических и 12,5% случаев привычных выкидышей являются анеуплоидии [1–3]. В этой связи, при угрожающем и привычном выкидыше оценка состояния эмбриона и диагностика хромосомных аномалий, которые наследуются от родителей или возникают de novo, является чрезвычайно актуальной.

В современных социальных условиях планирование и наступление беременности происходит у женщин старшего репродуктивного возраста, что повышает риск хромосомной патологии плода. Существующий на современном этапе скрининг беременных основывается на данных ультразвукового исследования (УЗИ) и определении материнских сывороточных маркеров. Наиболее эффективным методом скрининга трисомии 21 является оценка сочетания возраста матери, толщины воротникового пространства (измеренного при УЗИ) и биохимического исследования крови матери на свободный β-хорионический гонадотропин человека (β-ХГЧ) и протеин, ассоциированный с беременностью (PAPP-A) в сроке 11–13 недель беременности, с частотой выявления до 90% и уровнем ложноположительных результатов до 5,0% [2, 4, 5]. Согласно данным литературы, использование дополнительных биохимических и ультразвуковых маркеров, включая определение фактора роста плаценты в сыворотке, оценку носовых костей и кровотока через трехстворчатый клапан и венозный проток, может повысить частоту выявления хромосомной патологии [2, 4, 5].

При высоком риске патологии по результатам неинвазиного общепринятого теста в зависимости от срока беременности и клинической ситуации предлагаются инвазивные подтверждающие процедуры (биопсия ворсин хориона, амниоцентез, кордоцентез) (Приказ Минздрава России от 12 ноября 2012 г. № 572н).

Инвазивные процедуры, являясь диагностическим «золотым» стандартом, тем не менее, могут привести к осложнениям беременности вплоть до ее самопроизвольного прерывания в 1,0–5,0% случаев. Проведение инвазивной диагностики требует тщательного обоснования и в большинстве случаев противопоказано у женщин с осложнениями беременности, в частности с угрожающим выкидышем. Вместе с тем, именно правильная постановка диагноза при анеуплоидии плода приводит к выбору рациональной тактики ведения осложненной беременности.

В последние годы были разработаны методы неинвазивного пренатального тестирования анеуплоидий (Non Invasive Prenatal Test – NIPT, НИПТ) на основе анализа геномной ДНК, циркулирующей в крови матери и доступной для анализа уже с 10–11-й недели беременности [6–8]. Этому событию предшествовала серия исследований, проведенных за последние 15 лет, которые были посвящены вначале техническим аспектам методик, а затем их клиническому применению у пациенток высокого и среднего риска. Высказывалась точка зрения о необходимости НИПТ с определением свободной эмбриональной ДНК (сэ-ДНК) у женщин именно высокого риска анеуплоидии, чья беременность протекает с осложнениями, либо у женщин со средним риском для выбора правильной тактики ведения беременности [9–11].

Согласно результатам проведенных исследований, авторами определены ограничения метода:

Онкологические заболевания у беременной женщины.

Многоплодная беременность, включая случаи спонтанной редукции одного из плодов.

Уровень плодовой ДНК ниже порога аналитической чувствительности метода (обычно равной 4–5%), что часто наблюдается при сроках беременности менее 10–11 недель.

Индекс массы тела пациентки более 30 кг/м2.

Мозаицизм в соматических клетках матери по исследуемым хромосомам.

Наличие у пациентки донорских органов и тканей.

Примерно в 1% случаев ответ по НИПТ получить не удается.

Многими авторами подчеркивается важность определения уровня сэ-ДНК для оценки возможности проведения НИПТ. Так, при уровне сэ-ДНК менее 4% точность метода резко снижается. Помимо ограничений, связанных с ранним сроком беременности и ожирением, когда низкий уровень сэ-ДНК является ожидаемым феноменом, существуют наблюдения, в которых уровень менее 4,0% является индивидуальной особенностью отдельно взятой беременности и, в частности, функционирования фето-плацентарного комплекса. В этих случаях, уровень сэ-ДНК не повышается при повторном определении и должен расцениваться, как потенциально «опасный» фактор. Существуют данные, что при низком уровне сэ-ДНК повышен риск хромосомных аномалий. Второй вариант: низкий уровень сэ-ДНК является относительным на фоне высокого уровня материнской ДНК, обусловленным заболеванием или состоянием, ведущим к усиленному апоптозу тканей материнского организма. Независимо от причин, низкий уровень сэ-ДНК в приемлемые для определения сроки является показанием для углубленного обследования и в ряде случаев – для инвазивной диагностики.

В связи с тем, что в Китае имеет место самое большое в мире количество пациентов с редкими генетическими заболеваниями, НИПТ было реализовано в этой стране с 2010 года, однако правила, регулирующие правовые основы его выполнения, в Китае слабы. В одной из ранних клинических работ проведено НИПТ анеуплоидий у 212 беременных женщин на 8–12-й неделях беременности [5, 12–14]. Были проанализированы данные женщин только с высоким риском развития хромосомных аномалий.

Метод был использован для обнаружения анеуплоидий, а именно трисомий 21, 18, 13, Х и Y. Инвазивная пренатальная диагностика путем хориоцентеза и амниоцентеза была также предложена всем женщинам, для подтверждения как положительных, так и отрицательных результатов НИПТ.

С помощью НИПТ у 2 женщин выявлена трисомия по 21-й хромосоме, у 1 – трисомия по 18-й, в 1 случае – трисомия по 13-й хромосоме, что также было подтверждено результатами кариотипирования после хориоцентеза и амниоцентеза. Был один ложноположительный результат моносомии (45 X) и 2 ложноотрицательных результата. Также наблюдалось повышение уровней сэ-ДНК со сроком беременности от 8 до 12 недель. Методом НИПТ обнаружено, что в 95,0% исследуемых образцов уровень сэ-ДНК в крови был более 4,0%, что является достаточным для точного определения анеуплоидии плода. Было доказано, что доля сэ-ДНК является крайне низкой при ожирении и на очень ранних сроках беременности. Данное исследование было одним из первых в оценке точности НИПТ у женщин высокого риска.

Переломным в оценке места методов НИПТ стало исследование в данной области, опубликованное в 2014 г. группой ученых под руководством D. Bianchi, лидера в области работ, посвященных НИПТ в США [15]. Исследование выполнялось у 2042 женщин с июля 2012 по январь 2013 года в 21 медицинском центре 14 штатов США. Новизна данного исследования заключалась в использовании НИПТ у женщин низкого риска по хромосомным аномалиям плода. Целью этого многоцентрового проспективного ослепленного исследования явилось: сравнить результаты общепринятого скрининга на анеуплоидии с результатами высокопроизводительного секвенирования на трисомии 21, 18 и 13 у беременных низкого риска [15–17].

Полученные результаты были достоверными для трисомий 18 и 21, ложноположительные результаты были достоверно ниже при проведении секвенирования по сравнению с общепринятым скринингом. Отрицательный предиктивный результат секвенирования составил 100% Положительный предиктивный результат при секвенировании превосходил аналогичный показатель при общепринятом скрининге в 10 раз для трисомии 21, в 5 раз – для трисомии 18.

Данное исследование вызвало широкий резонанс в научных кругах Америки, Великобритании, Китае, странах Европы. Сообщества Великобритании и США высказали различные мнения о необходимости внедрения методов НИПТ по определению плодовой ДНК для беременных низкого риска по реализации хромосомной патологии [3, 15, 18]. Королевское общество акушеров-гинекологов Великобритании (RCOG) полагает, что в настоящее время НИПТ должна стать первичным звеном скрининга хромосомных аномалий во время беременности. В противоположность этому мнению, Американская ассоциация по фетальной медицине Society for Maternal Fetal Medicine (SMFM) осторожно заявляет, что НИПТ является многообещающим методом, который демонстрирует прекрасные результаты, но этого недостаточно, чтобы изменить существующие в настоящее время рекомендации Американского общества акушеров-гинекологов (ACOG) и специалистов по фетальной медицине (SMFM).

Тем не менее, исследования в области НИПТ у женщин низкого риска были продолжены. В 2015 году в Китае было проведено беспрецедентное по количеству включенных пациенток исследование – 146 958 женщин [5, 12, 15, 19]. Целью исследования явилось оценить клиническую эффективность НИПТ в выявлении трисомий 21,18 и 13 более чем на 140 000 клинических образцах. Проводилось сравнение точности метода НИПТ при беременности с низким уровнем риска и при беременности высокого риска по реализации хромосомных аномалий. Результаты исследования не выявили существенной разницы между 72 382 случаями с высоким уровнем риска и 40 287 случаями с низким уровнем риска (чувствительность 99,21 против 98,97%, р=0,82; специфичность 99,95 против 99,95%, р=0,98). Главными факторами, повлиявшими на ложноположительные и ложноотрицательные результаты НИПТ, были: уровень сэ-ДНК в крови матери и эмбриональный плацентарный мозаицизм.

Авторы обсуждают необходимость использования НИПТ в случаях, когда комбинированный тест выявил высокий риск трисомий, либо женщина старше 35 лет и желает пройти обследование. В таком случае, если трисомия не определяется методом НИПТ, есть возможность снизить частоту инвазивных процедур и избежать угрозы прерывания беременности. НИПТ может применяться в качестве универсального теста на анеуплоидии у всех беременных женщин, включая беременных низкого риска.

Многие исследования показывают, что НИПТ до сих пор не может быть альтернативой или заменить инвазивные процедуры, особенно в случаях мозаицизма, когда число анеуплоидных клеток уступает нормальным [2, 8, 20, 21]. Однако метод может быть использован для скрининга и определения риска у всех беременных, независимо от возраста до постановки окончательного диагноза, как самостоятельный метод, так и в дополнение к существующим методам. Исследователи полагают, что определение сэ-ДНК может заменить или усовершенствовать существующие скрининговые тесты. Подобные выводы были сделаны, основываясь на результатах нескольких проспективных исследований, во всех случаях подтвержденных классическим кариотипированием.

Вместе с тем, использование НИПТ ставит ряд этических вопросов. Несмотря на неинвазивность, данная технология направлена на выявление хромосомных анеуплоидий у плода, лечение которых на сегодняшний день невозможно. Поэтому ее применение не позволяет избежать этических проблем, свойственных пренатальной диагностике в целом, так как единственным способом предотвращения рождения больного ребенка является прерывание беременности.

Предлагаемая технология потенциально предназначена для замены существующего биохимического скрининга. Учитывая более высокую стоимость данного исследования, необходимо проведение специальных мероприятий по обеспечению доступности предлагаемого ДНК-скрининга для всех социальных групп.

При широком внедрении НИПТ существует вероятность использования его результатов в немедицинских целях, например, для селекции по полу [14, 15, 22–24]. Это следует учитывать при разработке нормативных документов, регламентирующих проведение массового ДНК-скрининга, в частности, представляется нецелесообразной выдача информации о поле плода на ранних сроках беременности, когда по действующему законодательству допускается прерывание беременности без медицинских показаний.

В нашей стране НИПТ также входит в повседневную практику и имеет большие перспективы. Отечественная валидация метода была проведена на базе ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России путем анализа 200 образцов женщин высокого риска, проходивших инвазивную пренатальную диагностику. Суммарная чувствительность ДНК-скрининга составила 100,00% (88,43–100%), специфичность – 98,79% (95,69–99,85%). Общая эффективность теста при анализе анеуплоидий по хромосомам 21, 18, 13, X и Y, определяемая как доля истинных результатов среди всех проведенных исследований, составила 98,97% (96,34–99,88%) [15, 23].

М.А. Курцер и соавт. (2015) провели исследование, посвященное использованию НИПТ для определения хромосомных анеуплоидий у беременных высокого и низкого риска (тест проводился за пределами Российской Федерации). Средний возраст женщин в исследуемой группе составил 34,6 года (от 19 до 45 лет), срок беременности 14,9 недели (от 9,2 до 24,1 недели). Результаты анализа сэ-ДНК были получены для 2010 (99,1%) из 2028 беременных. Точность тестов для синдрома Дауна составила 96,6% при уровне ложноположительных ответов 0,05%. Чувствительность теста для трисомии 21 достигла 100%. Из-за небольшого количества образцов с трисомиями 13,18, моносомией Х чувствительность для этих синдромов не рассчитывалась. У 611 плодов мужского пола, за исключением синдрома Клайнфельтера, была одна копия хромосомы Х и одна копия хромосомы У. У 589 плодов женского пола, за исключением двух случаев синдрома Тернера и одного случая триплоидии, число копий хромосомы Х было равно двум, точность метода для определения пола плода составила 100% [5, 12, 24].

Данное исследование показало, что НИПТ является точным методом для исследования хромосомных аномалий плода с ранних сроков беременности, который может быть рекомендован всем женщинам в качестве высокоэффективного пренатального теста.

Прежде всего, НИПТ значительно сократит применение инвазивных внутриматочных вмешательств, что особенно важно у женщин с осложненным течением данной беременности (угрожающий выкидыш, привычный выкидыш, возрастной риск, экстрагенитальная патология). Oбсуждение рисков, выгод и альтернативных методов пренатального скрининга, в том числе возможность исключения тестирования, следует проводить со всеми пациентами. Система, практикуемая в Нидерландах, заключается в разъяснении каждой женщине современных возможностей пренатального скрининга, включая НИПТ, после выполнения УЗИ в первом триместре. В случае, когда женщина настаивает на получении 100% точной информации, после подписания информированного согласия выполняется хориоцентез и кариотипирование. При незаинтересованности женщины в результатах скрининга (по религиозным или другим личным соображениям, не позволяющим прерывать беременность, даже в случае тяжелых хромосомных аномалий) специалисты по пренатальной диагностике ограничиваются УЗИ в 19–20 недель. Во всех остальных случаях пациентке предоставляется право выбора при разъяснении всех возможностей и ограничений НИПТ. Хотя любой пациент может выбрать НИПТ в качестве основной стратегии скрининга для выявления общих анеуплоидий независимо от статуса риска, при выборе этого исследования пациент должен понимать его ограничения и преимущества в контексте альтернативного скрининга и диагностических возможностей. Учитывая ограниченные данные о рентабельности НИПТ в странах с низким уровнем акушерского риска среди населения, в настоящее время стандартные методы скрининга остаются наиболее подходящим методом первой линии для большинства женщин. Однако, технологии, на которых основаны методы НИПТ и его применение в пренатальном скрининге анеуплоидий – это быстро меняющаяся область. Следовательно, рекомендации относительно использования в скрининговых программах НИПТ в ближайшее время будут пересмотрены. Важно оставаться в курсе этой быстро меняющейся технологии для предоставления пациентам информации о наиболее эффективных, точных и бережных методах скрининга на анеуплоидии.

References

1. Ailamazyan E.K., Kulakov V.I., Radzinsky V.E., Savelyeva G.M., ed. Obstetrics. National guideline. Moscow: GEOTAR-Media; 2009. 1218 p. (in Russian)

2. Benn P., Cuckle H., Pergament E. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013; 42(1): 15-33.

3. Bianchi D.W., Wilkins-Haug L. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? Clin. Chem. 2014; 60(1): 78-87.

4. Serova O.F., Tamazyan G.V., Sovaev N.I. et al. The clinical significance of morpho-functional state of the endometrium during reproductive disorders. Voprosyi ginekologii, akusherstva i perinatologii. 2010; 9(4): 43-48. (in Russian)

5. Song Y., Liu C., Qi H., Zhang Y., Bian X., Liu J. Noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies by massively parallel sequencing in a prospective Chinese population. Prenat. Diagn. 2013; 33(7): 700-6.

6. Van Lith J.M.M., Faas B.H.W., Bianchi D.W. Current controversies in prenatal diagnosis 1: NIPT for chromosome abnormalities should be offered to women with low a prioririsk. Prenatal Diagnosis. 2015; (35): 8-14.

7. Morain S., Greene M.F., Mello M.M. A new era in noninvasive prenatal testing. N. Engl. J. Med. 2013; 369(6): 499-501.

8. Masuzaki H., Miura K., Yoshiura K.I., Yoshimura S., Niikawa N., Ishimaru T. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism. J. Med. Genet. 2004; 41(4): 289-92.

9. Neyt M., Hulsstaert F., Gyselaers W. Introducing the non-invasive prenatal test for trisomy 21 in Belgium: a cost-consequences analysis. BMJ Open. 2014; 11: 5-15.

10. Papageorgiou E.A., Patsalis P.C. Non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidies: new technologies and clinical applications. Genome Med. 2012; 4(5): 46.

11. Palomaki G.E., Deciu C., Kloza E.M., Lambert-Messerlian G.M., Haddow J.E., Neveux L.M. et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet. Med. 2012; 14(3): 296-305.

12. Lo Y.M., Hjelm N.M., Fidler C., Sargent I.L., Murphy M.F., Chamberlain P.F. et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N. Engl. J. Med. 1998; 339(24): 1734-8.

13. Gil M.M., Quezada M.S., Bregant B., Ferraro M., Nicolaides K.H. Implementation of maternal blood cell-free DNA testing in early screening for aneuploidies. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013; 42(1): 34-40.

14. Fairbrother G., Johnson S., Musci T.J., Song K. Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population. Prenat. Diagn. 2013; 33(6): 580-3.

15. Bianchi D.W., Parker R.L., Wentworth J., Madankumar R., Saffer C., Das A.F. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N. Engl. J. Med. 2014; 370(9): 799-808.

16. American College of Obstetricians Gynecologists Committee on Genetics. Committee Opinion no. 545: noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet. Gynecol. 2012; 120(6): 1532-4.

17. Futch T., Spinosa J., Bhatt S., de Feo E., Rava R.P., Sehnert A.J. Initial clinical laboratory experience in noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy from maternal plasma DNA samples. Prenat. Diagn. 2013; 33(6): 569-74.

18. Wang S.J., Gao Z.Y., Lu Y.P., Li Y.L., You Y.Q., Zhang L.W. et al. Value of detection of cell-free fetal DNA in maternal plasma in the prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2012; 47(11): 808-12.

19. Lim J.H., Kim M.H., Han Y.J., Lee da E., Park S.Y., Han J.Y. et al. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy. PLoS One. 2013; 8(2): e56787.

20. Barrett A.N., Chitty L.S. Developing noninvasive diagnosis for single-gene disorders: the role of digital PCR. Methods Mol. Biol. 2014; 1160: 215-28.

21. Ishihara N., Matsuo H., Murakoshi H., Laoag-Fernandez J.B., Samoto T., Maruo T. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either PET or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002; 186(1): 158-66.

22. Leung T.N., Lau T.K., Chung T.Kh. Thalassaemia screening in pregnancy. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2005; 17(2): 129-34.

23. Sukhikh G.T., Karetnikova N.A., Baranova E.E., Shubina E.S., Korostin D.O., Ekimov A.N., Parsadanyan N.G., Gus A.I., Bakharev V.A., Trofimov D.Yu., Voevodin S.M., Tetruashvili N.K. Noninvasive prenatal diagnosis of aneuploidies by next-generation sequencing (NGS) in a group of high-risk women. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2015; (4): 5-10. (in Russian)

24. Kurtser M.A., Gnetetskaya V.A. A noninvasive prenatal test in the diagnosis of chromosome aneuploidies. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2015; (8): 65-9. (in Russian)

Received 22.01.2016

Accepted 29.01.2016

About the Authors

Tetruashvili Nana K., Doctor of Medicine, Head of the Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954381477. E-mail: tetrauly@mail.ru
Kim Lyudmila V., Graduate student, Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79162338372. E-mail: kimika@mail.ru
Parsadanyan Nane G., Candidate of Medicine, obstetrician-gynecologist, Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79263304241. E-mail: nnnpars@mail.ru
Fedorova Nataliy I., candidate of Medicine, obstetrician-gynecologist Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954381477. E-mail: natasha_fedorova@mail.ru
Trophimov Dmitrii Y., Ph.D. in medical sciences, Head of Laboratory of molecular genetic methods Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954384951. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Shubina Ekaterina S., Graduate student, laboratory of molecular genetic methods, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79267218717. E-mail: e_shubina@oparina4.ru

For citations: Tetruashvili N.K., Kim L.V., Parsadanyan N.G., Fedorova N.I., Barkov I.Yu., Shubina E.S., Trofimov D.Yu. Noninvasive prenatal DNA test as a screening procedure for women from different risk groups: A view on the problem. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2016; (8): 24-28. (in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.8.24-28
By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.