Цервикальная патология занимает одно из ведущих мест в структуре гинекологической заболеваемости, так как затрагивает большой контингент молодых женщин и отражается на их репродуктивном здоровье. По данным мировых статистик, инфекция, вызванная вирусом папилломы человека (ВПЧ), является важной проблемой общественного здравоохранения, встречается у 50–80% населения и в 99,7% случаев гистологически подтвержденного рака шейки матки (РШМ) [2]. Несмотря на современные методы диагностики и лечения цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) II и III, включая ножевую конизацию шейки матки, риск возникновения рака остается высоким.
В связи с этим встает вопрос о разработке эффективных программ послеоперационного динамического наблюдения за больными. Цитологическое исследование с использованием классификации национального института Здоровья США (классификации Bethesda) является основным скрининговым и диагностическим методом в выявлении патологии шейки матки, включая CIN. Однако чувствительность цитологического метода исследования, по данным разных авторов, составляет 66–83%, специфичность – 60–85%. Большие надежды возлагаются на жидкостную цитологию, которая повышает чувствительность данного метода, и, кроме того, делает более доступными иммуноцитохимические (ИЦХ) и молекулярные методы для выявления онкопатологии.
Наиболее перспективными онкомаркерами в диагностике ЦИН являются p16 (INK4a) и Ki-67. Белок
р16 (INK4a) – регулятор клеточного цикла, широко используется в качестве диагностического маркера
предрака и рака как в цитологических мазках, так и в гистологических препаратах [9]. Показано, что
степень сверхэкспрессии белка р16 (INK4a) пропорциональна тяжести цервикального поражения
[18]. Этот диагностический маркер лучше выявляет ЦИН II по сравнению с морфологией и ВПЧ-тестированием [6]. Иммуноцитохимическое исследование с определением уровня экспрессии р16 (INK4a) сравнимо по своей клинической значимости с гистологическим диагнозом последующих цервикальных биопсий [8]. Ki-67 – маркер пролиферации, который экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, кроме G0. Этот белок имеет тенденцию к росту в опухолях человека, и степень экспрессии маркера отражает степень малигнизации. Иммуногистохимические исследования по экспрессии Ki-67 в биоптатах шейки матки с низкой и высокой степенями неоплазии показали увеличение пролиферации, а также сильную взаимосвязь Ki-67 и р16 (INK4a) в ВПЧ-ассоциированных CIN II и III [19]. Недостаточно изучено значение онкомаркеров р16 и Ki-67 в динамическом наблюдении результатов ножевой конизации как метода лечения больных CIN II и III.
Тестирование образцов на наличие ДНК высокого онкогенного риска широко используется как
в скрининговых программах по выявлению РШМ, так и в клинической практике для предотвращения
развития данной патологии. Американская коллегия акушеров и гинекологов рекомендует тестировать больных, прошедших лечение по поводу CIN, для выявления онкогенных типов ВПЧ [21]. Большая вирусная нагрузка – серьезный риск развития рецидива заболевания. Возможность рецидива CIN в первые 2 года после лечения оценивается различными цифрами: 1,1–11,8% [7], 14% [14], 17,7% [5], 17,9% [12]. Для выявления вирусной ДНК используют как методы с выделением ДНК-образца, например гибридизации с РНК-зондом – Hybrid Capture II [7], метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [20], которые позволяют не только типировать вирусную ДНК, но и оценить вирусную нагрузку, так и без предварительного выделения ДНК, например гибридизация in situ [10] и ПЦР in situ [22]. В настоящее время перспективным методом скрининга РШМ считается молекулярно-биологическое тестирование клеток эпителия шейки матки, проводимое параллельно с цитологическим исследованием. Тест Cobas 4800, выявляющий 14 типов ВПЧ высокого онкогенного риска и имеющий возможность сбора материала в среду для жидкостной цитологии, позволяет выявить предраковые/раковые изменения шейки матки на ранней стадии [17].
Цель данного исследования – изучить значение комплекса клинико-морфологических методов
исследования и молекулярного тестирования ВПЧ в эпителии цервикального канала в мониторинге
больных, перенесших конизацию по поводу CIN.
Материал и методы исследования
Проведено проспективное клинико-морфологическое и молекулярно-биологическое исследование материала, полученного от 167 женщин с патологией шейки матки, проходивших обследование
и лечение в НЦ АГиП им. академика В.И. Кулакова за период 2008–2011 гг. Группу сравнения составили 30 женщин с цервицитом и ВПЧ-инфекцией 6–11-го типов по результатам ПЦР. Пациентки были в возрасте от 17 до 42 лет (средний возраст 28,3±4,5 года).
Обследование больных проводили по общепринятому протоколу: клинический осмотр, взятие
мазков и их цитологическое исследование с оценкой мазков по системе Bethesda [21], выявление
высоко онкогенных типов ВПЧ методом ПЦР, в случаях цитологического диагноза H-SIL в последующем проводилась кольпоскопия с прицельным повторным взятием цитологических мазков
из зоны трансформации и измененных участков шейки матки с иммуноцитохимией на р16 (INK4а)
(клон Е6Н4, CINtec cytology kit, mtm laboratories, Германия) и Ki-67 (клон MIB1, Dako, Дания) по общепринятым методикам [11]. При подтверждении диагноза H-SIL делали расширенную кольпоскопию с прицельной биопсией и/или диагностическое выскабливание шейки матки с иммуногистохимией на р16 (INK4а) и Ki-67 (рис. 1, см. на вклейке).
Выявление CIN III явилось показанием для проведения ножевой конизации шейки матки в сочетании с выскабливанием слизистой оболочки цервикального канала и в ряде случаев – слизистой оболочки полости матки. CIN III диагностирована у 55 пациенток, в связи с чем им проведена высокая ножевая конизация шейки матки. CIN II–III выявлена у 112 пациенток, которые прооперированы методом ножевой конизации. Операционный материал (конус шейки матки) полностью подвергался гистологическому исследованию: фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине, заливался в парафин, изготавливались серийные парафиновые срезы, которые окрашивались гематоксилином и эозином, проводилось иммуно-гистохимическое выявление р16 (INK4а) и Ki-67 по общепринятым методикам [11].
Мониторинг пациенток в поcлеоперационном периоде включал кольпоскопический, цитологический, ИЦХ (р16 – INK4а и Ki-67) методы контроля не реже, чем один раз в три месяца. Выборочно проводили ПЦР c выявлением ДНК двадцати одного типа ВПЧ высокого онкогенного риска. Время наблюдения с момента проведения конизации составило не менее 2 лет. Женщины были подразделены на три группы: первую составили 55 пациенток, прооперированных по поводу CIN III; вторую – 112 женщин, прооперированных по поводу CIN II и III; третью – 30 женщин с цервицитом. Главной задачей в мониторировании пациенток после конизации шейки матки является раннее обнаружение остаточной или рецидивирующей цервикальной патологии в связи с риском прогрессирования в инвазивную карциному. Основным
методом контроля пациенток после конизации было цитологическое исследование [4].
Известно, что в связи с репаративными и атрофическими изменениями слизистой оболочки
цитологический тест иногда дает ложно-отрицательные результаты, что делает его менее чувствительным [5]. Для повышения чувствительности и усиления специфичности цитологического анализа мы дополнили его ИЦХ методом с использованием молекулярных маркеров р16 (INK4a)
и Ki-67. Цитологический и ИЦХ контроли проводили с использованием жидкостной цитологии,
которая уменьшает число ложноотрицательных результатов по сравнению с традиционными мазками и повышает выявляемость цервикального рака [3]. Кроме того, жидкостная цитология позволяет из одной пробы выполнить не только цитологическое исследование, но и ИЦХ, типирование
ВПЧ методом ПЦР, а также гибридизацию с целью оценки вирусной нагрузки и физического состояния вирусной ДНК (эписомальная или интегрированная форма), что важно для прогнозирования
течения заболевания [13]. Для приготовления мазков использовали центрифугу Сyto-Tek (Sakura,
Япония). Из одной пробы делали мазки для цитологии и окрашивали их гематоксилином и эозином, а также отдельные мазки для иммуноцитохимии и для типирования ВПЧ. В мазках выявляли
молекулярные маркеры Ki-67 и с помощью набора CINTec cytology p16 (INK4а), согласно протоколу
производителя. Иммуноцитохимические реакции проводились в DAKO Autostainer. При проведении
реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве положительного контроля
использовали верифицированные гистологические срезы с CIN III, в качестве отрицательного
контроля – мазки обследованных здоровых женщин с отсутствием ВПЧ в анамнезе.
Цитологическими критериями рецидива CIN служили выявленные ASC-US, L-SIL и H-SIL, а ИЦХ критериями – высокие уровни экспрессии онкомаркеров р16 (INK4а) и Ki-67, обнаруживаемые в 10% и более атипичных эпителиальных клеток.
При помощи ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени проводили дифференциацию двадцати одного типа ВПЧ (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82) и количественное определение ДНК вируса (комплект реагентов производства «ДНК-технология», Россия). При выделении ДНК из исследуемых образцов использовали комплект реагентов «Проба-ГС» («ДНК-технология», Россия).
Результаты исследования и обсуждение
На первом этапе мониторирования проводили цитологическое исследование мазков цервикального канала, приготовленных методом жидкостной цитологии. У 38 человек выявлен рецидив (рис. 2, см. на вклейке): Н-SIL – 2 (0,01%) пациентки, L-SIL –3 (0,02%) и ASC-US –33 (19,8%). Мазки остальных 159 женщин не содержали атипичных клеток плоского эпителия.
H-SIL обнаружили у одной (1,8%) женщины из первой и у одной (0,9%) из второй групп.
Мазки H-SIL характеризовались наличием крупных комплексов и разрозненно лежащих атипичных клеток плоского эпителия полиморфного вида с резко выраженным дискариозом (рис. 2Г, см. на вклейке). L-SIL выявили у одной (1,8%) пациентки из первой (СIN III) и у двух (1,8%) из второй (CIN II–III) групп (рис. 2В, см. на вклейке). В мазках L-SIL обнаружили комплексы и разрозненно лежащие клетки плоского эпителия с легким дискариозом, а также наблюдали
койлоциты и много сохранных зрелых клеток.
ASC-US выявили у 10 (18,2%) пациенток первой и 23 (20,5%) второй групп, в мазках которых
присутствовали комплексы и отдельно лежащие клетки плоского эпителия с укрупненными и гиперхромными ядрами в рамках реактивных изменений, койлоциты (рис. 2Б, см. на
вклейке).
Пациенток с диагнозом: клетки без признаков атипии, было большинство – 43 (80%) женщины
из первой группы и 86 (26,7%) из второй группы. Мазки содержали единичные койлоциты, лейкоциты, пласты плоского и цилиндрического эпителия с реактивными изменениями и явлениями лейкопедеза, атипичные клетки отсутствовали (рис. 2А, см. на вклейке).
У женщин контрольной группы с цервицитом в мазках обнаруживалис реактивные изменения
плоского и цилиндрического эпителия, явления лейкопедеза и единичные койлоциты. Атипичные
клетки отсутствовали. На втором этапе динамического контроля полученные цитологические данные уточняли, проведя ИЦХ исследования с использованием онкомаркеров (рис. 3, см. на вклейке).
Диагноз H-SIL подтвердился в обоих случаях, верифицированных цитологически. При этом экспрессия Ki-67 достигала 80–90% (рис. 3В, см. на вклейке), а p16 (INK4а) – 80–100% (рис. 3Г, см. на вклейке) в атипичных клетках плоского эпителия. Диагноз L-SIL, по данным ИЦХ исследования, поставили в 2 из 3 случаев. У двух пациенток экспрессия Ki-67 (рис. 3А, см. на вклейке) и p16 (INK4a)
(рис. 3Б, см. на вклейке) в эпителиальных клетках достигала 15–20% в отдельных клетках и комплексах плоского эпителия с укрупненными ядрами. В то же время у третьей пациентки с цитологическим заключением L-SIL диагноз был изменен на хронический цервицит с репаративными изменениями после проведения ИЦХ, исследования в связи с обнаружением низкой экспрессии p16 (INK4a) в единичных клетках покровного эпителия и отсутствием экспрессии Ki-67. После ИЦХ, исследования мазков у женщин с цитологическим диагнозом ASC-US в 31 случае отметили низкую экспрессию Ki-67 и отсутствие р16 (INK4a), что позволило перевести этих пациенток в группу без признаков атипии. У женщин из второй группы отметили повышение уровня экспрессии Ki-67 и p16 (INK4a) до 15–20% от общего числа клеток, что позволило поставить им диагноз L-SIL и отнести их в первую группу. Цитологический диагноз ASC-US требует серьезного внимания и дальнейшего исследования для того, чтобы не пропустить начальные стадии развития РШМ. У пациенток с диагнозом ASC-US есть риск, хотя и невысокий, развития данного процесса [15].
В результате комплексного исследования были выявлены 6 (3,6%) человек с L-SIL. При этом у 2 женщин из 167 после конизации обнаружили H-SIL, что было подтверждено гистологически при исследовании биоптатов шейки матки. У одной больной СIN III развилась через 24 месяца после конизации шейки матки. У второй женщины проведена пангистерэктомия через год после первой операции.
У женщин контрольной группы с цервицитом в мазках обнаруживались единичные Ki-67 положительные эпителиальные клетки. Экспрессия p16 (INK4a) в эпителиальных клетках отсутствовала.
На третьем этапе динамического мониторинга для оценки вирусной нагрузки исследовали цитологический материал 14 женщин после конизации по поводу CIN III и CIN II–III. Провели ПЦР в режиме реального времени и в 11 из 14 образцов получили результаты, в 3 образцах не было достаточного количества материала для исследования.
В образцах от двух пациенток с H-SIL лишь у одной выявили высоко онкогенный 16-й тип ВПЧ, причем
количество вирусной ДНК имело клинически весомое значение: 103 копий ДНК ВПЧ на 105 клеток, или
1 копия ДНК на 100 клеток эпителия. Отсутствие вирусной ДНК у второй пациентки с диагнозом H-SIL можно объяснить развитием предраковых изменений, происходящих на определенном этапе уже без участия вируса как одного из этиологических факторов РШМ, что совпадает с нашими данными по локализации вирусной ДНК в срезах ткани шейки матки, полученными методами ПЦР in situ и хромогенной гибридизации in situ (СISH) [1]. Из четырех пациенток с L-SIL вирусную ДНК выявили у одной женщины. Следует отметить, что это был 44-й тип ВПЧ с низким онкогенным риском [16]. Однако настораживало его количество – 105 копий вирусной ДНК на 105 эпителиальных клеток, а это повышенная вирусная нагрузка, что нашло отражение и в ИЦХ-диагнозе: L-SIL. По-видимому, этот тип вируса способствует прогрессии неопластического процесса за счет индукции воспаления и пролиферации клеток, приводя к накоплению мутаций. Сорок четвертый тип ВПЧ мало изучен, так как его определяют только при расширенных исследованиях. Из 5 женщин с отсутствием атипических клеток в ИЦХ исследовании у одной выявили клинически значимое количество вирусной ДНК. То обстоятельство, что при одинаковой вирусной нагрузке у одной пациентки развился рецидив по цитологии H-SIL, а у другой на данный момент не было клинических, цитологических и ИЦХ проявлений патологии шейки матки, подтверждает тот факт, что наличие вирусной ДНК еще не означает развития злокачественной трансформации клеток шейки матки, а определение ДНК ВПЧ не может быть
единственным методом контроля больных после лечения СIN III. Вместе с тем выявление клинически значимых концентраций вирусной ДНК требует более внимательного мониторинга больной. Возможно, что через небольшой интервал времени количество перерастет в качество, что приведет к развитию CIN. Полученные данные согласуются с данными многоцентрового клинического исследования, выполненного с использованием системы Сobas 4800, с участием 47 тысяч женщин [17], в ходе которого было показано, что у женщин 25–30 лет и старше положительные результаты на ДНК ВПЧ коррелируют с высоким риском развития предраковых/раковых изменений шейки матки.
При изучении отдаленных результатов хирургического лечения в 2 (1%) случаях выявили повторное
развитие CIN III, подтвержденное гистологически, что потребовало выполнения операции в объеме высокой ампутации шейки матки и пангистерэктомии. Встает вопрос, является данное заболевание рецидивом или повторно развившейся новой опухолью. Можно предположить, что при разнице 1–2 года между возникновением первой и второй опухоли речь идет, скорее всего, о рецидиве предракового процесса в шейке матки. При этом следует отметить, что, по всей вероятности, рецидив возникает из трансформированных клеток с измененным геномом, которые могут оставаться в краях резекции или глубоко в криптах (рис. 1, см. на вклейке), при этом вирус папилломы в них может и не присутствовать, что было показано нами ранее [1]. По данным литературы, источником рецидива могут быть сохранившиеся трансформированные клетки в глубоких отделах крипт, не удаленные при конизации [5].
Таким образом, применение жидкостной цитологии для исследования процессов, происходящих
в шейке матки, в сочетании с ИЦХ-исследованием для определения экспрессии ВПЧ-ассоциированного
белка р16 (INK4a) и маркера пролиферации Ki-67 позволяет более точно верифицировать диагноз, разъясняя характер морфологических изменений как в случаях гипердиагностики рецидива, так и в случаях недостаточной диагностики. Результаты ВПЧ-тестирования позволяют увидеть, что вирусная ДНК не исчезла, возможен рецидив заболевания и требуется внимательный динамический контроль пациенток, прошедших лечение CIN III. При этом наиболее перспективным, по данным многоцентрового клинического исследования [17], является проведение морфологического и молекулярно-биологического исследований с использованием системы
Сobas 4800 в одном и том же образце, что является более экономичным и менее травматичным для
пациенки.
