В настоящее время проблема бесплодия является одной из самых актуальных и приоритетных в медицине развитых стран, учитывая неблагоприятные демографические показатели народонаселения. По статистике Всемирной Организации Здравоохранения с проблемой зачатия сталкиваются не менее 15% супружеских пар репродуктивного возраста [1].
По данным отчета Российской ассоциации репродукции человека за 2016 год в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) частота наступления беременности из расчета на перенос эмбриона в полость матки составила 38,7% и не имеет выраженной тенденции к росту [2].
Одной из причин неэффективности программ ЭКО являются неудачи имплантации, которые могут произойти при:
- нарушении рецептивности эндометрия, которое в ряде случаев обусловлено различными гинекологическими заболеваниями (эндометриоз, наличие полипов эндометрия, последствия перенесенных воспалительных заболеваний, нарушение гормональной регуляции) [3–5];
- наличии хромосомных аномалий у эмбриона [6, 7];
- утолщении zona pellucida, затрудняющем высвобождение эмбриона и его прикрепление к эндометрию, что чаще встречается у женщин старшего репродуктивного возраста [8, 9].
Изучение микробиоты матки и ее влияния на успешность имплантации является предметом исследований последних лет.
Микробиота – это совокупность микроорганизмов, представленных в отдельном биотопе человека, находящихся в симбиозе с организмом хозяина. Несмотря на то, что эти симбиотические отношения сложились эволюционно, наше понимание физиологической и патофизиологической роли микробиоты в большей степени остается недостаточным [10, 11].
Важность физиологической роли микробиоты различных биотопов продемонстрирована на здоровых волонтерах в исследовании «Human Microbiome Project» (HMP), проведенном сотрудниками Национального Института Здоровья США в 2007 году с использованием высокочувствительных молекулярно-генетических методов.
Изучены образцы биоматериала, полученные из полости рта, носа, с поверхности кожи, фекальные пробы. У женщин исследовали отделяемое влагалища и аспират из полости матки. Для определения видового состава микробиоты использовали метод секвенирования субъединицы 16S рибосомальной РНК (рРНК), уникальной для каждой бактерии и содержащей определенное число гипервариабельных участков, служащих идентификаторами генов. Данные HMP и других исследований показали, что в организме человека такие биотопы, как полость матки и плацента, ранее считавшиеся стерильными, колонизированы своей уникальной микрофлорой [10–13].
Следует отметить, что большая часть исследований микробиоты репродуктивного тракта основана на изучении образцов, полученных из влагалища. В норме в вагинальной микробиоте здоровой женщины доминируют лактобациллы, хотя данный показатель характеризуется значительной вариабельностью и зависит от многих факторов, таких как возраст, показатели гормонального статуса и др. Например, вагинальная микрофлора в детстве представлена ассоциациями факультативно и облигатно-анаэробных бактериальных популяций, которые включают роды Prevotella, Streptococcus, Staphylococcus и представителей семейства Enterobacteriaceae. Под влиянием эстрогенов в период полового созревания происходит нарастание уровня гликогена и снижение pH вагинальной среды, что обуславливает в дальнейшем доминирование лактобацилл [14–17].
Методы исследования микробиоты
Микробиота репродуктивного тракта преимущественно исследуется двумя методами: культуральным и молекулярно-генетическим.
Культуральный метод
Культуральные методы, несмотря на стремительное развитие микробиологии и появление новых способов идентификации бактерий, таких как времяпролетная масс-спектрометрия – MALDI-TOF-MS, имеют ограничения. К ним можно отнести длительность и трудоемкость исследования при выявлении полимикробных ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов (особенно строгих анаэробов), требующих получения чистых культур для видовой идентификации, и оснащение микробиологических лабораторий специальным оборудованием [14]. Кроме того, при культуральном исследовании не представляется возможным выявлять труднокультивируемые формы, затруднена идентификация микроорганизмов, требующих длительной инкубации (Megasphaera spp., Mobiluncus spp., и др.). Cущественным ограничением культурального метода является необходимость обеспечения жизнеспособности микроорганизмов, что накладывает жесткие требования к хранению и транспортировке биоматериала [18, 19]. В последние годы накоплены данные, свидетельствующие о способности микроорганизмов к образованию биопленок, что значительно затрудняет их выявление, и соответственно, делает невозможным дальнейшее эффективное лечение нарушений микробиоценоза и воспалительных процессов [10].
Большая часть ранних работ, описывавших микробиоту репродуктивного тракта, основана на культуральных методах диагностики. В 2005 году Adrews W. с соавторами провели исследование по изучению состава микрофлоры эндометрия у 820 пациенток, имевших в анамнезе спонтанные преждевременные роды (n=375), индуцированные преждевременные роды (n=142) и своевременные роды (n=303). Материал получали с помощью пайпель-биопсии. После аспирации образца эндометрия, не вынимая пайпель из полости матки, стерильными ножницами срезали наконечник, стерильным шприцем аспирировали содержимое пайпеля и затем помещали полученный материал на поверхность питательной среды в чашке Петри [20].
В результате проведенной работы не обнаружено существенной разницы в микробной обсемененности эндометрия среди женщин со спонтанными преждевременными родами по сравнению с индуцированными преждевременными родами (85% против 79%, р=0,102), а также при сравнении спонтанных преждевременных родов и спонтанных своевременных родов (85% против 81%, р=0,123). В группе женщин, имевших в анамнезе спонтанные преждевременные роды, наиболее часто выделялись Gardnerella vaginalis (G. Vaginalis) – у 45 (12%) женщин, Lactobacillus spp. – у 40 (10,7%), Streptococcus viridans – у 17 (4,5%), Peptostreptococcus spp. – у 16 (4,2%), Mycoplasma hominis –у 8 (2,3%) и Ureaplasma urealyticum – у 8 (2,3%) женщин.
Культуральным методом оценивали состояние микробиоты полости матки в своей работе Чертовский М.Н. и Кулинич С.И. в 2013 году. В исследование были включены 287 пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия после неудачных попыток ЭКО. Всем женщинам с 5 по 8 дни менструального цикла проводилась гистероскопия с взятием биоптата эндометрия на гистологическое и культуральное исследование, а также выполнена расширенная кольпоскопия. Патология эндометрия, не выявленная перед программой ЭКО по данным ультразвуковго исследования и пайпель-биопсии, обнаружена у 252 (87,9%) женщин, при этом в структуре преобладал хронический эндометрит с частотой 78,7%. У большинства пациенток (n=238) превалировала микрофлора, представленная полимикробными ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов. У 196 (68,2%) женщин при кольпоскопии выявлены признаки хронического воспаления шейки матки [21].
Молекулярно-генетические методы исследования
Относительно недавно появился новый подход к изучению микробиоты репродуктивного тракта, в частности, полости матки с помощью молекулярно-генетических методов исследования.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее востребованным методом диагностики. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка молекулы ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro), что необходимо в связи со сложностями детекции единичных молекул ДНК. С помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В стандартных условиях длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.
ПЦР в режиме реального времени – это не только качественный метод, но и количественный, основанный на стандартной ПЦР, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК [22, 23].
В исследование Hilier S. включены 136 женщин с хронической тазовой болью, которым выполняли пайпель-биопсию эндометрия с последующим гистологическим исследованием и микробиологической оценкой с помощью культурального метода и ПЦР. У 55 (40%) женщин с клиническими признаками хронической тазовой боли эндометрит был подтвержден гистологически. Из 53 образцов эндометрия получили широкий спектр бактерий, представленный 63 различными видами, включая 8 видов условно-патогенных микроорганизмов. Присутствие истинных патогенов, таких как Neisseria gonorrhoeae и/или Chlamydia trachomatis, в образцах эндометрия было ассоциировано с эндометритом (29% и 6%, р<0,001). Среди условно-патогенных микроорганизмов при эндометрите, подтвержденном гистологически, достоверно чаще выявляли G.vaginalis (35% против 16%, р=0,01, ) и A. vaginae (22% против 3%, р<0,001) [22].
Наиболее распространенный способ анализа видового разнообразия бактерий основан на секвенировании 16S рРНК. Этот ген характеризуется тем, что некоторые его участки обладают высокой консервативностью, что позволяет подобрать универсальные праймеры, а некоторые, наоборот, настолько вариабельны, что позволяют проводить видовую идентификацию большого числа известных микроорганизмов.
Таким образом, используя последовательности гена 16S рРНК, можно проводить оценку биоразнообразия микроорганизмов. Метод не является количественным, однако дает возможность провести их видовую (или родовую) идентификацию в составе микробных сообществ, а также относительно недорог [23, 24].
В исследовании Mitchell M. и соавторов изучены образцы из полости матки 58 женщин, полученные после гистерэктомии. Материал для исследования получали из верхней части эндоцервикса и тела матки после ее вскрытия в стерильных условиях. Отделяемое влагалища отбирали до операции. Анализ проводили с помощью метода секвенирования 16S рРНК. Микробная обсемененность полости матки выявлена у 55 (95 %) пациенток, из них у 52 обнаружен только 1 вид микроорганизма. Наиболее распространенными видами были: Lactobacillus iners (L. iners) (у 45% женщин выявлялись из полости матки и у 61% женщин – из влагалища), Prevotella spp. (у 33% – из полости матки, у 76% – из влагалища), Lactobacillis crispatus (L. crispatus)(у 33% – из полости матки, у 56% – из влагалища). G.vaginalis, A. vaginae и Lactobacillus jensenii (L. jensenii) обнаружены во влагалище более, чем у 40% женщин, но значительно реже в полости матки (G.vaginalis у 19% женщин, A.vaginae – у 10% женщин и L. jensenii – у 20%). Колонизация микроорганизмами полости матки оказалась значительно ниже, чем влагалища. Маркеры воспаления в эндометрии существенно не различались у женщин, у которых не обнаружено микроорганизмов в полости матки по сравнению с теми, у которых были обнаружены только лактобациллы, или присутствовали микробы, ассоциированные с бактериальным вагинозом [13].
Таргетное секвенирование и использование биологических микрочипов основаны на анализе нуклеотидных последовательностей гена гипервариабельных участков 16S рРНК и обладают высокой специфичностью, позволяющей идентифицировать микроорганизмы до рода и вида. Данные, полученные с помощью этих методов, подвергаются биоинформационной обработке. Для таргетного секвенирования используется обычно метод СЭНГЕРА, который позволяет установить последовательность небольших фрагментов ДНК – до 1000 нуклеотидов в одном исследовании. Этот метод вполне подходит для анализа одного или нескольких небольших генов [23].
При полногеномном анализе используется тотальная ДНК – то есть вся ДНК, присутствующая в пробе. Несмотря на свою дороговизну, полногеномное секвенирование позволяет охарактеризовать весь геном микроорганизмов и получить информацию о различиях между генами отдельных штаммов бактерий. Можно идентифицировать определенные участки ДНК, отвечающие, например, за устойчивость к антибиотикам [23].
Метагеномика – новое направление биологии, посвященное изучению генетического материала (метагенома) сообществ микроорганизмов в совокупности. Главной целью метагеномики является секвенирование всех геномов для установления видового состава и метаболических взаимосвязей в сообществе. При секвенировании метагеномов вся ДНК, которая находится в пробирке, используется для секвенирования. Это позволяет анализировать все микроорганизмы, входящие в состав сообщества и находящиеся в образце. Данные, полученные в ходе метагеномного секвенирования, могут быть обработаны и собраны в кластеры, называемые операционными таксономическими единицами для сопоставления с общедоступными таксономическими базами данных. Достоинством метагеномного секвенирования является то, что этот метод позволяет получить информацию о наличии или отсутствии геномов различных микроорганизмов, а недостатком – невозможность оценить их жизнеспособность. Кроме того, могут возникать сложности при количественной оценке микроорганизмов. Важной особенностью метагеномных исследований можно считать отсутствие необходимости в изоляции и культивировании микроорганизмов, что является принципиальным моментом, поскольку не все из них растут на питательных средах [25–27].
Использование молекулярно-генетических методов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)
В последнее время появляется все больше научных работ по изучению микробиоты полости матки во время переноса эмбриона в программах ЭКО с помощью различных методов секвенирования.
В исследование, проведенное Franasiak J.M. с соавторами были включены 33 пациентки. После переноса эмбриона в полость матки каждой женщины дистальную часть эмбриокатетера помещали в стерильную пробирку для ПЦР. Анализ микробиоты полости матки проводили с использованием метода секвенирования 16S рРНК.
В результате изучено 35 образцов биоматериала: 33 образца, полученных от пациенток и 2 контрольных, содержащих Escherichia coli. У 18 из 33 женщин беременность наступила и у 15 пациенток – не наступила. Суммарно в исследуемых образцах зарегистрировано присутствие 278 различных генов микроорганизмов. Микробиота полости матки во время переноса эмбриона в обеих группах характеризовалась преобладанием лактобацилл [12].
В исследовании Moreno I. с соавторами проведен сравнительный анализ микробиоты парных образцов аспирата эндометрия и влагалищного отделяемого в пререцептивной (спустя 2 дня после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ)) и рецептивной (спустя 7 дней после пика ЛГ) фазах одного менструального цикла у 13 фертильных женщин (суммарное количество образцов равно 52). Для оценки гормонального воздействия на микробиоту эндометрия аспират из полости матки был взят дважды (в пререцептивной и рецептивной фазах одного менструального цикла) у 22 фертильных женщин (общее количество образцов равно 44). Оценивали влияние микробиоты матки на репродуктивные исходы (частота имплантации, наступления и прогрессирования беременности, частота живорождения) у 35 бесплодных женщин в программе ЭКО (общее количество образцов равно 41).
Исходя из исследования микробиоты полости матки, включавшей 191 таксон микроорганизмов, было выделено две группы женщин: I группа – с доминированием лактобацилл (>90%) и II – с наличием в микробиоте более 10% других видов бактерий и без доминирования лактобацилл (<90%).
Во II группе отмечено снижение частоты имплантации, по сравнению с I группой (60,7 / 23,1%), наступления беременности (70,6 / 33,3%) и живорождения (58,8 / 6,7%) [28].
В исследовании, проведенном Verstraelen H. и соавт., изучали состав микробиоты эндометрия с помощью глубокого секвенирования V1-2 участков гена 16S рРНК у 19 пациенток с повторными неудачами имплантации, повторными выкидышами или с обоими исходами. Авторы работы для получения материала с целью исключения контаминации с микрофлорой влагалища использовали цитощетку Tao Brush, которая представляет собой щетку, окруженную прозрачным кожухом, защищающим взятую пробу от контаминации отделяемым эндоцервикса и влагалища. В результате проведенного исследования во всех образцах были представлены 15 филотипов микроорганизмов. У 90% пациенток выявлен схожий состав микробиоты полости матки, в котором преобладали Bacteriodes xylanisolvens, B.thetaiotaomicron и B.fragilis.
На другом филотипическом уровне у 6 женщин отмечено преобладание L.crispatus или L.iners при наличии Bacteriodes. Два эндометриальных сообщества имели сильные различия. При отсутствии Bacteriodes в одном случае доминировали L.crispatus, в другом – Prevotella spp., A.vaginae и Mobiluncus curtisii. Результаты данного исследования согласуются с предыдущими, свидетельствующими о дисбиотических сдвигах в микробиоте эндометрия при отсутствии преобладания лактобацилл, и такие нарушения являются наиболее частыми в субфертильной популяции [29].
Микробиом эндометрия у бесплодных пациенток оценен в исследовании Tao X. с соавторами, где изучалось содержимое дистальной части катетера, использованного при переносе эмбриона с помощью метагеномного анализа. В исследование включены образцы микробиоты полости матки, полученные у 70 пациенток, которым проводилась программа ЭКО. Из 70 образцов были отобраны 33, в которых содержалось более 90% лактобацилл и 50 образцов, в которых было обнаружено 70% лактобацилл. Помимо лактобацилл выявлены условно-патогенные микроорганизмы: Corynebacterium spp. – у 40 женщин, Bifidobacterium spp. – у 15, Staphylococcus spp. – у 38 и Streptococcus spp. – у 38 женщин [30].
Таким образом, молекулярно-генетические методы исследования позволяют оценить взаимосвязь между микробиотой полости матки и частотой имплантации эмбриона в программе ЭКО. Назначение женщинам антибиотиков и пробиотиков с учетом микробной обсемененности полости матки может улучшить репродуктивный исход в программах ВРТ.
Заключение
Учитывая вышеизложенные данные, мы считаем, что изучение микробиоты матки является крайне важным и необходимым для дальнейшего понимания роли микроорганизмов в исходах программ ВРТ. С учетом актуальности данного вопроса в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова» Минздрава России начато исследование по изучению микробиоты полости матки и цервикального канала у женщин в момент переноса эмбриона. В аэробных и анаэробных условиях с расширенным составом специальных селективных и неселективных питательных сред проводится культуральное исследование образцов отделяемого цервикального канала и наружных стенок катетера, извлеченного из полости матки после переноса эмбриона, с последующей идентификацией микроорганизмов методом MALDI-TOF-MS и секвенированием 16S рРНК. В результате проводимого исследования планируется разработка алгоритма ведения пациенток с повторными неудачами имплантации в зависимости от микробной обсемененности.
