Cell technologies in the treatment of female stress urinary incontinence

Проблема недержания мочи (НМ) у женщин приобретает в последние годы все большую актуальность. По данным эпидемиологических исследований, частота НМ составляет во Франции, Германии и Великобритании 41–44%, в Испании – до 23%, в Швеции и Австралии – до 34%. В России неконтролируемую потерю мочи отмечают 30% женщин крупных городов в возрасте 25–74 лет [2]. Стрессовое НМ составляет 51–77% от всех типов НМ, смешанное – от 11 до 39%, ургентное – от 10 до 12%.

Известно несколько патофизиологических механизмов формирования стрессового НМ: оно может быть вызвано анатомическими нарушениями в области уретры (гипермобильностью) или нарушениями функции сфинктера уретры, связанными с потерей эластичности и нарушениями смыкания (недостаточность сфинктера уретры – НСУ) [26]. Доказано, что роды через естественные родовые пути являются главным фактором риска развития стрессового НМ, так как происходит компрессия и повреждение нервных волокон, перерастяжение мышц и соединительнотканных структур [13]. По мнению многих авторов, дефицит эстрогенов также приводит к биохимическим, клеточным, анатомическим и бактериологическим изменениям в мочевом тракте, что проявляет себя в атрофии влагалища, снижении тонуса сфинктеров и повышении чувствительности мочевого пузыря. Также констатирована корреляция между возрастом женщин и степенью снижения объема и плотности мышечных элементов уретры и ее сфинктера [2, 5].

Целью лечения стрессового НМ является восстановление мышечной и соединительной ткани сфинктера уретры, ограничение подвижности уретры без создания при этом обструкции. В настоящее время консервативные методы лечения стрессового НМ, такие как тренировка мышц тазового дна, фармакологические препараты малоэффективны [23, 33]. Хирургические методы лечения, такие как создание искусственного сфинктера уретры, слинговые уретропексии, введение объемообразующих средств в некоторых случаях достаточно эффективны, однако могут приводить к серьезным осложнениям: развитию инфекции, повторным операциям, инфравезикальной обструкции [29, 44]. Поэтому остается актуальной проблема разработки эффективных малоинвазивных методов лечения стрессового НМ, связанного с НСУ.

В связи с развитием клеточных технологий и регенеративной медицины разрабатываются новые подходы к лечению стрессового НМ, основанные на трансплантации стволовых/прогениторных клеток (СПК) и тканеинженерных конструкций (ТИК). В основе данных подходов лежит предположение о дифференцировке трансплантированных клеток в специализированные клеточные элементы уретры, мочевого пузыря и тканей тазового дна и стимуляции продукции межклеточного вещества собственными клетками.

В 2006 г. в США было проведено мультицентровое исследование по оценке эффективности инъекции суспензии хрящевых клеток в альгинате в шейку мочевого пузыря у 32 женщин со стрессовым НМ. В результате лечения полную ремиссию наблюдали у 50% больных (16 женщин удерживали мочу в течение 1 года наблюдения), остальные отмечали частичный эффект (от 3 до 12 мес). Авторы пришли к выводу о необходимости проведения повторных инъекций [42, 43].

Следующим вариантом клеток, на которые возлагают большие надежды, являются скелетные миобласты или миосателитные клетки. Применение миобластов для восстановления рабдомиосфинктера уретры может быть перспективным, так как имеет следующие преимущества: таргентность, требуется небольшое число клеток в связи с небольшим размером мышцы и технически простая доступность сфинктера уретры для хирургических вмешательств [36]. В последнее время проводится много экспериментальных и клинических исследований по применению этих клеток при стрессовом НМ. M. Chancellor и соавт. [8] вводили трансфицированные репортерным геном миобласты в стенку мочевого пузыря и уретры. Через 3–4 дня после трансплантации клетки выявляли в стенке обоих органов, при этом они образовывали характерные миотубы. В исследованиях C. Collins и соавт. и G. Smythe и соавт. витально вводили меченые миобласты в область поврежденного внутреннего сфинктера уретры мышей и свиней с помощью микрошприца. На 35-й день было отмечено, что толщина сфинктера увеличивалась за счет новообразованных мышечных волокон, причем значительная часть мышечных волокон была представлена трансплантированными мечеными миобластами. Авторы отметили, что трансплантация клеток стимулирует не только регенерацию мышечной ткани сфинктера, но и восстановление иннервации [9, 35].

Исследования безопасности и эффективности трансплантации аутогенных миобластов уже находятся на клинической стадии [32]. На сегодняшний день FDA (Food and drug administration) одобрила шесть клинических исследований по применению скелетных миобластов при стрессовом НМ, одно из которых в III фазе. До 2015 г. в данное исследование будут включены 246 пациентов из многих стран Европы и Канады, по дизайну оно является рандомизированным двойным слепым плацебоконтролируемым. В случае подтверждения безопасности и эффективности данная медицинская технология войдет в широкую клиническую практику.

Однако не все исследователи считают миобласты оптимальным вариантом клеточного трансплантата для лечения стрессового НМ [38]. В последнее время внимание исследователей привлекают мультипотентные стромальные клетки (МСК), так как они являются более технологически доступными, обладают бóльшей пролиферативной активностью, пластичностью и, соответственно, бóльшим регенераторным потенциалом [34, 37, 42]. МСК можно выделить из красного костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови, вартонова студня и других тканей, где присутствует строма. Процессинг этих клеток позволяет получать более гомогенную клеточную культуру, что позволяет нивелировать индивидуальные различия клеточного состава трансплантатов. Также известно, что МСК обладают иммуносупрессивной активностью, и это позволяет применять эти клетки для аллогенной трансплантации [14, 21]. Наряду с возможностью дифференцироваться в остео-, хондро-, адипогенном направлениях [12, 48], МСК могут спонтанно или индуцировано дифференцироваться в кардиомиоциты [40], эндотелий [20] и, по некоторым данным, даже в нейроны [45]. Поэтому гипотетически, при трансплантации возможны восстановление мышечных элементов, соединительной ткани, стимуляция ангиогенеза, что в целом может обеспечить более выраженный терапевтический эффект.

S. Kim и соавт. на модели двустороннего иссечения срамного нерва у крысы после трансплантации в парауретральную область МСК костного мозга выявили в стенке уретры новообразованные мышечные клетки и значительное улучшение уродинамических показателей. М. Cruz и соавт. после трансплантации МСК костного мозга также обнаружили меченые клетки в сфинктере, при этом они имели морфологическую структуру скелетных мышечных клеток [10]. В исследовании P.A. Zuk и соавт. продемонстрировано, что через 8 нед после инъекции МСК в уретру и мочевой пузырь отмечается экспрессия α-актина гладкомышечных клеток [48]. В другом исследовании G. Lin и соавт. трансплантировали клетки, выделенные из жировой ткани, полученные путем липоаспирации периовариальной клетчатки, в уретру на животной модели стрессового НМ. Авторы отметили, что у оперированных животных нормализовался акт мочеиспускания, кроме этого при морфологическом и иммуногистохимическом исследованиях наблюдали более высокое содержание эластических волокон и гладкомышечных клеток, чем у нелеченных животных [22]. Интересные результаты были продемонстрированы при использования МСК жира в комбинации с фактором роста нервов и полигликолевой кислотой при стрессовом НМ у крыс. В случае введения комбинированного варианта трансплантата авторы добились более хороших результатов по сравнению с моновариантами [6].

Основываясь на опыте предыдущего исследования, логично предположить, что использование комбинации СПК и матриц-носителей, которые одновременно могут быть и объемобразующими препаратами, может быть значительно эффективнее применения этих технологий в моно варианте. ТИК при сравнении с суспензионными клеточными трансплантатами обладают рядом преимуществ. Во-первых, в ТИК существенно повышается выживаемость и ограничивается миграция клеток в трансплантате. Во-вторых, клетки, прикрепленные к поверхности носителя, более активно пролиферируют и синтезируют межклеточное вещество, сигнальные молекулы, обеспечивая прорастание конструкции собственными соединительной тканью и кровеносными сосудами [25]. В-третьих, материал носителя (коллаген, гиалуроновая кислота и др.) сам обладает кондуктивными свойствами, стимулирует образование коллагена, миграцию собственных незрелых клеток [46]. Все эти преимущества теоретически должны обеспечить высокую эффективность применения ТИК при стрессовом НМ.

При разработке биоматериалов необходимо учитывать многие факторы, такие как биосовместимость, скорость распада до биополимеров, структуру и механические свойства [30]. Такие биоматриксы должны обеспечить таргентную доставку клеток в нужную часть уретры или шейки мочевого пузыря, сохранять трехмерную архитектуру для формирования новой ткани и регулировать образование ткани с определенными функциями (мышечные или соединительные ткани) [18, 19, 41].

Важен выбор размера микрочастиц носителя: инженерные конструкции, превышающие по размеру несколько сотен микрон, не способны адекватно васкуляризоваться, вследствие чего происходит сосудистый некроз трансплантированных клеток. Для решения данной проблемы в последнее время стали применять сосудистые ростовые факторы, например сосудистый эндотелиальный фактор роста, который стимулирует ангиогенез в самой конструкции и окружающих тканях [11, 31, 39].

Поэтому перед исследователями стоит задача создать такой медицинский продукт, который был бы лишен этих недостатков. В одном из наших исследований мы поставили перед собой задачу разработать ТИК, которая обеспечит формирование дополнительных объемов соединительной ткани для ограничения подвижность уретры, укрепления ее стенки и сфинктеров [3]. При этом матрица-носитель должна обеспечивать сохранность клеток при малоинвазивном (инъекционном) способе введения, а также фиксировать клетки в месте введения.

В качестве носителя ТИК мы предложили использовать желатиновую губку. Для приготовления препарата, пригодного для инъекционного введения, блоки желатиновой губки измельчают с помощью дисперсионного гомогенизатора. В процессе разработки протокола при различных режимах работы гомогенизатора мы получили разные по величине частицы желатиновой губки. Дальнейшие исследования показали, что оптимальный размер частиц колеблется от 100 до 500 микрон [7]. В качестве клеточного компонента ТИК были использованы МСК жировой ткани, которые характеризуются высокой пролиферативной активностью и активным синтезом внеклеточного матрикса [17], а также более выраженной способностью образовывать коллагеновые волокна по сравнению с клеточными культурами из других источников [24, 35, 43].

В результате трансплантации ТИК вокруг уретры сформировался валик соединительной ткани с высокой плотностью клеточных элементов, толстыми пучками коллагеновых волокон с упорядоченной ориентацией. На ранних сроках (7–14-е сут) в области введения было выявлено значительное количество клеточных элементов различного происхождения [4]. В группах, где вводили клеточные культуры, преобладали фибробласты и фиброциты, а в контрольных – макрофаги (рис. 1, см. на вклейке). Помимо перечисленных клеточных типов до 30 сут наблюдения обнаруживали клетки трансплантата, что подтверждалось иммуногистохимическим исследованием и обнаружением витальной метки зеленого белка (GFP). По данным разных авторов, при трансплантации в парауретральную область меченых клеток экспериментальным животным, их можно обнаружить в уретре, влагалище, прямой кишке [1, 10] на сроках наблюдения от 10 до 24 сут [47].

При детальном изучении состава трансплантата было показано, что в основных группах наблюдения с введением клеточных культур преобладали клетки фибробластического дифферона, в группе, где вводили ТИК с аутологичной культурой, их число было максимальным. Следует отметить, что количество фибробластов и фиброцитов группах наблюдения соответствует уровню образования коллагеновых волокон (рис. 2).

Среднее значение площади коллагеновых волокон на всех сроках наблюдения была значительно выше в основных группах эксперимента (рис. 3).

В исследованиях последних лет большое внимание уделяется роли дисплазии соединительной ткани при стрессовом НМ. По данным Rechberger и соавт., в соединительной ткани женщин, страдающих стрессовым НМ, выявляется значительно меньшее количество коллагеновых волокон по сравнению со здоровыми [28]. В связи с этим выбор клеточной культуры при трансплантации должен быть обусловлен в первую очередь не возможностью СПК дифференцироваться в специализированные клетки, в том числе и миобласты, а активным синтезом межклеточного вещества, прежде всего, коллагеновых волокон [15].

Следует отметить, что в данной работе ТИК вводили в парауретральную соединительную ткань. В месте введения образовывалась также соединительная ткань, что может говорить об ортологии процессов регенерации и влиянии микроокружения на дифференцировку стромальных клеток. Так, при введении аналогичной ТИК в область, представленную преимущественно жировой тканью, отмечалось образование жировой ткани [16].

Заключение

Несмотря на то что методы клеточной терапии стрессового НМ скоро будут широко применяться в клинической медицине, в этой области регенеративной медицины остается еще много нерешенных вопросов. В частности, по-прежнему отсутствует единая точка зрения на выбор типа клеток для трансплантации. Следующей нерешенной проблемой является отсутствие четких представлений о механизмах терапевтической активности трансплантации клеток при стрессовом НМ. Способны ли СПК дифференцироваться в скелетные и гладкие миоциты стенки уретры и мочевого пузыря, или же морфологические изменения, возникающие в этих органах после трансплантации, обусловлены паракринной индукцией синтетических процессов в соединительной ткани? Ответ на это вопрос позволил бы окончательно определиться с выбором клеточного трансплантата. Однако уже сейчас в данной области совершенно явно наблюдается тренд применения клеток не в виде суспензии, а с использованием матриц-носителей, т.е. в виде ТИК. Согласно теоретическим и экспериментальным предпосылкам, это должно существенно увеличить эффективность существующих методов клеточной терапии. Предложенная нами инъекционная форма ТИК на основе стромальных клеток жировой ткани в комбинации с матрицей-носителем из желатина лишена основных недостатков и имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами клеточной терапии стрессового НМ. После трансплантации ТИК обеспечивает формирование в парауретральной области дополнительной соединительной ткани, что может обеспечить ограничение подвижности уретры, укрепление ее стенки и сфинктеров. В дальнейшем мы планируем изучить эффективность и безопасность ее трансплантации на соответствующей экспериментальной животной модели стрессового НМ.

Работы выполнялись при финансировании Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 гг. (соглашение № 8068).