Проточная цитофлюориметрия (ПЦМ) является высокотехнологичным методом быстрого анализа клеток или микрочастиц, находящихся в суспензии. Этим методом на выборках от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток могут исследоваться множество клеточных характеристик – поверхностные и внутриклеточные молекулы и структуры, функциональная и ферментативная активность, стадии пролиферативного цикла. Проточная цитометрия широко используется при изучении молекулярных и клеточных механизмов функционирования мужской репродуктивной системы. В настоящее время большое внимание уделяется выявлению нарушений функций сперматозоидов, определяющих их сниженную оплодотворяющую способность, у пациентов с нормальными показателями спермограммы.
Маркером нарушения репродуктивной функции является присутствие антиспермальных антител (АСАТ), взаимодействующих с антигенами живых сперматозоидов, в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта у мужчин и у женщин. Поэтому первой попыткой использования ПЦМ для диагностики нарушений репродуктивной функции у мужчин явилась разработка метода выявления АСАТ на поверхности живых сперматозоидов [1]. Однако было установлено, что клеточная реакция сперматозоидов, индуцируемая образованием поверхностных комплексов антиген-антитело, может приводить к активации метаболизма сперматозоидов, акросомной реакции, разрушению мембран клеток и получению ложнонегативных результатов при выявлении АСАТ [2,3]. Поэтому мы отказались от применения ПЦМ для диагностики мужского аутоиммунного бесплодия, однако предложенный нами метод используется для диагностики иммунного фактора бесплодия у женщин. Наличие АСАТ IgG, IgA и IgM классов в цервикальной слизи выявляется у 22% пациенток с бесплодием неясного генеза.
Одной из возможных причин бесплодия может быть сниженная оплодотворяющая способность сперматозоидов, обусловленная нарушениями акросомной реакции (АР) – рецептор-опосредованного экзоцитоза акросомного содержимого, обеспечивающего проникновение сперматозоида через оболочки яйцеклетки. Нами разработан объективный способ оценки АР с помощью окрашивания сперматозоидов двумя флуоресцентно меченyыми лектинами – ТРИТЦ-A.hypogaea, связывающимся с b-D-галактозильными остатками, локализованными на наружной акросомной мембране, и ФИТЦ-P.sativum, который взаимодействует с основным компонентом акросомного матрикса – акрозином [4]. Предложенный метод позволяет эффективно диагностировать бесплодие, обусловленное дисфункцией сперматозоидов, у 32% бесплодных пациентов с нормальными показателями спермограммы.
Молекулярные аспекты АР в настоящее время активно исследуются, однако до сих пор не идентифицированы поверхностные рецепторы сперматозоидов, обеспечивающие связывание гамет с физиологическими лигандами. Поэтому большой интерес представляет недавно выявленная активность ангиотензинпревращающего фермента, локализованного на поверхности сперматозоидов (5) и, по-видимому, непосредственно влияющего на процесс оплодотворения [6].
Современным подходом к выявлению дисфункций сперматозоидов является оценка качества ДНК и хроматина с помощью методов TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferases dUTP Nick End-Labeling). Метод TUNEL включает в себя прямое мечение одно- и двухцепочечных разрывов («ников») в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используется флюоресцеин. Интенсивность флюоресценции пропорциональна числу встроенных dUTP и, соответственно, числу разрывов в ДНК. Однако данные об эффективности использования предлагаемого метода в клинической практике остаются спорными [7].
Внедрен в практику лаборатории новый метод анализа клеточного состава эякулята. Оценивается степень связывания флуоресцентного зонда пропидия иодида с ДНК сперматозоидов, лейкоцитов и клеток сперматогенеза. Тест предназначен для выявления факторов мужского бесплодия - лейкоцитоспермии и нарушений сперматогенеза.
Исследования, проведенные на экспериментальных животных, с очевидностью доказали ключевую роль семенной плазмы (СП) в иммунорегуляции имплантации. С помощью мультиплексного анализа цитокинового состава семенной плазмы нами было впервые установлено, что контакт с СП полового партнера в цикле ЭКО/ИКСИ может оказывать как благоприятное, так и негативное влияние на частоту наступления беременности, что определяется цитокиновым статусом семенной плазмы полового партнера [8, 9]. Очевидно, что при избытке содержания компонентов СП, оказывающих неблагоприятное влияние на имплантацию, решающее значение для повышения эффективности ЭКО может иметь ограничение поступления СП в репродуктивный тракт женщины.
Использование проточной цитофлуориметрии может внести существенный вклад в развитие представлений о молекулярных основах репродукции человека, а также иметь большое практическое значение для диагностики бесплодия у мужчин и выбора оптимальных способов коррекции репродуктивной функции.
